Sincronizzazione nematode: un metodo per ottenere popolazioni di vermi in fasi di sviluppo identiche

-Inizia posizionando vermi autofertilizzanti nella loro ultima fase larvale su piatti seminati con una fonte di cibo batterico. Lascia che le larve si sviluppino in adulti maturi fino a quando non c'è abbondanza di uova all'interno dei vermi e deposte sui piatti. Lavare i piatti con tampone per raccogliere le uova e i vermi.

Quindi, sostituire il buffer con una soluzione di candeggina che dissolve i vermi adulti. Protetti dal guscio d'uovo, gli embrioni sopravviveranno a questo trattamento, anche se saranno in diverse fasi di sviluppo. Quindi sostituire la candeggina con tampone e consentire lo sviluppo degli embrioni. Mentre le larve si schiudono dai loro gusci d'uovo in assenza di cibo, lo sviluppo si fermerà nella prima fase larvale.

Trasferire le larve su piatti con cibo per riprendere lo sviluppo. Ciò stimolerà la progressione sincrona attraverso gli stadi larvali rimanenti.

Quando i vermi raggiungono l'ultimo stadio larvale, spostali in piastre con cibo e FUdR, un inibitore della sintesi del DNA che impedisce la produzione di prole. Il continuo sviluppo in presenza di FUdR produce una popolazione di vermi adulti sterili. In questo esperimento sincronizziamo una popolazione del nematode C. elegans.

-Per iniziare, trasferire larve L4 di background genetici desiderati su un prato appena seminato di Escherichia coli su mezzi di crescita di nematodi o piastre NGM. Utilizzare almeno due piastre da 100 millimetri o tre piastre da 60 millimetri per ogni deformazione.

Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata per tre o quattro giorni o fino a quando le piastre non sono concentrate con un gran numero di uova e vermi gravidi. Lavare le uova e i vermi dalle piastre usando circa sei millilitri di tampone M9 per un piatto di nematodi di 100 millimetri. Utilizzando pipette Pasteur in vetro, trasferire le uova e i vermi in singoli tubi di centrifuga da 15 millilitri per ogni ceppo. Far girare questi tubi per tre minuti a 6.180 g.

Dopo la centrifugazione, aspirare il tampone M9 mantenendo solo l'animale e il pellet di uova. Aggiungere da tre a quattro millilitri di soluzione di candeggina ad ogni tubo e vortice intermittente per sei minuti.

Quindi aggiungere il buffer M9 per riempire ogni tubo e girare a 6.180 g per un minuto. Aspirare il supernatante e ripetere questo lavaggio con M9 tre volte.

Dopo il lavaggio, spostare il pellet di uova in un tubo fresco da 15 millilitri contenente circa nove millilitri di tampone M9. Sincronizzare i vermi appena nati nutando a 20 gradi Celsius per 16-48 ore.

Dopo aver filato questi tubi a 6.180 g per 1,5 minuti, mettere gli animali L1 sincronizzati su un prato appena seminato di OP50 su singole piastre NGM. Mantenere i piatti a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali raggiungono lo stadio larvale L4 dopo circa 42 ore. In questo momento, utilizzare un piccone di platino per spostare le larve L4 su piastre NGM sementi OP50 contenenti 0,5 milligrammi per millilitro di FUdR per impedire loro di produrre progenie.