Overview
In questo video, mostriamo un metodo per produrre una popolazione sincronizzata per lo sviluppo di C. elegansadulti sterili . Il protocollo di esempio sincronizza i worm per studiare i tassi di consumo di ossigeno negli animali vivi.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Sarasija e Norman, Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Crescita e sincronizzazione della popolazione di nematodi
Questi animali raggiungeranno lo stadio larvale L4 dopo ~ 42 h. In questo momento, spostare le larve L4 usando un piccone di platino su piastre NGM sementi OP50 contenenti 0,5 mg/mL 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUdR) per impedire loro di produrre progenie.
NOTA Assicurarsi che all'interno di un esperimento tutti i ceppi siano sincronizzati per un periodo di tempo simile. Il trattamento FUdR sterilizza gli animali e previene la deposizione delle uova e la produzione di progenie, che potrebbero influenzare l'OCR. Questi animali sterilizzati verranno analizzati il giorno successivo (giorno 1 animale adulto a ~ 66 h) per il saggio. È stato riferito che la FUdR ha avuto un impatto sulla fisiologia e sulla durata della vita di alcuni vermi mutanti. Pertanto, questo dovrebbe essere preso in considerazione quando il farmaco viene utilizzato per la sterilizzazione. I vermi possono anche essere sterilizzati mediante mutazioni femminizzante come fem-1 (hc17) o fem-3(e2006). Tuttavia, queste mutazioni potrebbero avere un impatto sulla funzione mitocondriale.
- Trasferire larve L4 di origine genetica desiderata (ad esempio, N2 [tipo selvatico] e animali sel-12) su piatti di mezzi di crescita nematodi (NGM) (vedi tabella 1 per ricetta) appena seminati con un prato di Escherichia coli (OP50). Utilizzare almeno due piastre da 100 mm o tre piastre da 60 mm per ogni deformazione. Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata (tra 15-25 °C) per 3-4 giorni o fino a quando le piastre non sono concentrate con un gran numero di uova e vermi gravidi.
- Lavare le uova e i vermi dalle piastre utilizzando circa 6 ml di tampone M9 (vedi tabella 1 per ricetta) per piatto di nematodi da 100 mm e trasferirli con pipette Pasteur in vetro in singoli tubi di centrifuga da 15 ml per ogni ceppo. Spin questi tubi verso il basso per 3 minuti a 6.180 x g e aspira il tampone M9, mantenendo solo gli animali e il pellet di uova.
- Aggiungere 3-4 ml di soluzione di candeggina (vedi tabella 1 per la ricetta) a ciascun tubo e vortice intermittente per 6 min. Ripetere questo lavaggio con M9 tre volte e spostare il pellet di uova in un tubo fresco da 15 ml contenente circa 9 ml di tampone M9.
- Sincronizzare i vermi appena nati nutando a 20 °C per 16-48 ore. Far girare questi tubi a 6.180 x g per 1,5 minuti e mettere gli animali L1 sincronizzati su singole piastre NGM appena seminate con un prato di OP50 (circa 6.000-10.000 animali per piastra da 100 mm) e mantenere a 20 °C.
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Representative Results
Tabella 1: Ricette per piatti NGM, tampone M9 e soluzione di candeggina.
| M9 buffer (1 L) | |||
| DH2O | 1.000 mL | ||
| NaCl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL *aggiungere dopo l'autoclave | ||
| Diviso tra 2 bottiglie: 500 mL ciascuna. Autoclave su ciclo liquido (esposizione di 15 minuti) | |||
| Soluzione di candeggina (50 mL) | |||
| DH2O | 36 mL | ||
| candeggiare | 14 mL | ||
| 10 N NaoH | 800 μL | ||
| Piastre standard nematode growth media (NGM) | 1 L | 0,5 L | 0,25 L |
| NaCl | 3 g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-peptone | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| un. Autoclave su ciclo liquido (esposizione di 45 minuti), lasciare raffreddare a ~60 °C e quindi utilizzare la tecnica sterile e aggiungere quanto segue: |
|||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| 5 mg/mL di colesterolo | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| B. Ruotare per mescolare accuratamente dopo ogni aggiunta. Dopo aver fatto tutte le aggiunte, versare le piastre |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
