Volwassen Drosophila-hersenen monteren: een methode om dia's voor confocale beeldvorming voor te bereiden

- Hecht op een positief geladen microscoopschuif twee afdekslips met voldoende afstand ertussen om een ruimte te creëren voor de Drosophila-hersenen die moeten worden gemonteerd. Pipetteer onder de stereomicroscoop de hersenen in het montagemedium in die ruimte. De negatieve lading van het weefsel zal de hersenen helpen zich te hechten aan de positieve lading op het oppervlak van de dia.

Verwijder het overtollige montagemedium om een nauwkeurige positionering van de hersenen op de dia mogelijk te maken in een rasterpatroon met de antennelobben naar boven gericht, en overbrug vervolgens de twee afdekstroken door een derde hoes over te steken om de hersenen te bedekken.

Om de holte op te vullen, plaatst u het montagemedium één druppel per keer in de rand van de holte en laat u het zich verspreiden door capillaire beweging, zodat het de hersenen niet verstoort.

Sluit de holte af met nagellak en bewaar bij negatieve 20 graden Celsius in het donker om de fluorescentie van bevlekte weefsels te behouden.

In het voorbeeldprotocol zullen we Drosophila-hersenen monteren voor confocale beeldvorming van immunostained neuronen.

- Om de hersenen te monteren, bouwt u een brugschuif. Plaats twee basisdeksels die ongeveer een centimeter uit elkaar glijden op een positief geladen glijbaan. Zorg ervoor dat de positief geladen kant naar boven is. Plak vervolgens de afdekplaten aan de glijbaan met vingernagellak en laat de lak volledig drogen voordat u verder gaat.

Plaats vervolgens de dia onder een stereomicroscoop en pipetteer hersenen in medium in de ruimte tussen de afdekslips. Zorg ervoor dat u de verlichting aanpast om de visualisatie van de hersenen te verbeteren.

Aspireer vervolgens de extra montagemedia van de dia, waarbij u voorzichtig moet zijn om de hersenen te vermijden. Laat vervolgens de resterende overtollige montagemedia weg. Hierdoor kunnen de hersenen nauwkeuriger worden gepositioneerd. Nu, met behulp van een tang, oriënteer de hersenen in een rasterpatroon met hun antennelobben naar boven gericht.

Plaats vervolgens een hoesslip over de hersenen en gebruik vingernagellak om de randen van de bovenste hoesstrook af te dichten die aan de basisafdekkingsslips zijn bevestigd.

Laad nu de middelste holte met verse montagemedia, zodat de media onder de afdekstrook kunnen worden getrokken door capillaire actie. Wanneer de holte is gevuld, sluit u deze volledig af met duidelijke vingernagellak.