Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- כדי להתחיל, לטבול חרקים מורדמים בתמיסת אתנול 70% כדי להפחית את ההידרופוביות של הקוטיקל.
לאחר מכן, הסר את הראש והבטן מבית החזה. השתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ עדין על צומת קוקסה-בית החזה, וניתק את הרגל.
לאחר מכן, להסיר את פתרון הקיבעון ולשטוף את הרקמה מספר פעמים עם מלוחים אגירה פוספט המכיל חומר ניקוי. לפני ההרכבה, למקם את הרגליים טהור או מדלל מעט חיץ הרכבה לפחות יום אחד כדי לספק מספיק זמן עבור החיץ להיכנס לרקמה.
לבסוף, הר את הרגליים בטיפה של מדיום הרכבה.
בדוגמה הבאה, נראה את הניתוח, הקיבעון וההרכבה של רגלי דראוסופילה מלנוגאסטר.
- התחל על ידי מילוי המספר המתאים של בארות בצלחת multiwell זכוכית עם 70% אתנול.
לאחר לא יותר מדקה אחת, יש לשטוף את הזבובים שלוש פעמים עם תמיסת ניקוי חומרים פעילי שטח לא-אונית ב-0.3% מלוחים עם אגירה פוספטית למשך 10 דקות לפחות לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, יש להשתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש והבטן של כל זבוב מבלי לפגוע בקטע בית החזה או ברגליים, ולהשתמש בקצה של זוג מלקחיים עדינים כדי להפעיל לחץ בעדינות אך בתקיפות על צומת קוקסה-בית החזה כדי לנתק רגל אחת ממקטע בית החזה.
מניחים את הרגליים בבאר אחת של צלחת multiwell חדש, המכיל טרי מוכן 4% paraformaldehyde על הקרח, עבור דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- חשוב לדחוף את הרגליים בעדינות לתוך חוצץ הקיבעון מבלי לתת להם לצוף כדי להשיג רגליים קבועות היטב.
- למחרת, לשטוף את הרגליים חמש פעמים טרי 0.3% פתרון דטרגנט פעילי שטח nonionic במשך 20 דקות לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, להחליף את חומר הניקוי עם מדיום הרכבה ולשמור את הרגליים במדיום הרכבה לפחות 24 שעות.
למחרת, להוסיף כ 20 microliters של 70% גליצרול ליד הקצה המצופה של שקופית מיקרוסקופ זכוכית לכסות את גליצרול עם כיסוי 22 על ידי 22 מילימטר. הבא, להוסיף על 10 מיקרוליטר קו הרכבה בינוני מימין coverlip ולהחיל קו השני 30 מיקרוליטר של הרכבה בינונית מימין לקו 10 מיקרוליטר.
באמצעות מלקחיים עדינים, מעבירים רגל אחת מהצלחת המולטיוולית בטיפה בינונית לרצועת הרכבה של 10 מיקרוליטר בצד חיצוני למעלה או למטה.
