Genetics
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फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धि द्वारा मध्यस्थता किए गए क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रिपिपिटेशन द्वारा प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन की ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड प्रोफाइलिंग
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Summary May 18th, 2020
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यहां हम स्तनधारी कोशिकाओं में आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपीएस) के आरएनए लक्ष्यों को निर्धारित करने के लिए फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धि के साथ Fbioक्लिप-एसईक्यू नामक एक संशोधित क्लिप-एसईक्यू प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Transcript
केवल और केवल बाध्यकारी प्रोटीन कई जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। यह फ्लैग-बायोटिन क्लिप-सेक्यू विधि, इसलिए स्तनधारी कोशिकाओं में आरएनए और आरबीपीएस की विशेष और लौकिक व्यवस्था को विश्व स्तर पर प्रोफाइल करने के लिए। यह विधि एसडीएस-पेज और झिल्ली हस्तांतरण प्रक्रियाओं के बिना प्रत्यक्ष प्रोटीन-बाध्य आरएनए का कुशल पता लगाने की अनुमति देती है।
पारंपरिक क्लिप-सेक्यू की तुलना में आइसोटोप मुक्त है और इसमें प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है। एक 10 सेंटीमीटर प्लेट में लगभग 3 मिलियन माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं चढ़ाना और उन्हें रात भर इनक्यूबेटिंग द्वारा शुरू करते हैं। अगले दिन, एक वैक्यूम के साथ माध्यम को हटा दें और कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए के दो मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
ताजा MESC माध्यम के चार मिलीलीटर के साथ ट्रिपसिन बुझाएं, और कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसके बाद उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए 300 बार जी पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनिटेंट को हटा दें। ठंडे पीबीएस के चार मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित करें और उन्हें क्रॉस-लिंकिंग के लिए 10 सेंटीमीटर प्लेट में वापस स्थानांतरित करें।
कोशिकाओं को 254 नैनोमीटर यूवी लाइट के साथ विकीर्ण करें, फिर क्रॉस-लिंक्ड कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए 300 बार जी पर स्पिन करें, फिर सुपरनेट को हटा दें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार तैयार बफर ए के 500 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को lyse करें। कोशिकाओं को आरएनएई-मुक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और उन्हें 30 से 60 मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DNAse 1 के 30 माइक्रोलीटर के साथ lysate का इलाज करें। इसके बाद 05 मोलर ईडीटीए के चार माइक्रोलीटर डालकर रिएक्शन बंद करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12, 000 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा अघुलनशील गोली नीचे स्पिन, और एक नया पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
सेल को पूर्व समतुल्य ध्वज मोतियों में स्थानांतरित करें, और दो से चार घंटे तक घुमाते हुए नमूना को चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद 3000 बार जी पर दो मिनट के लिए मोतियों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनिटेंट को हटा दें। नमूना करने के लिए बफर ए के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पांच मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड, तो नीचे मोतियों स्पिन और सुपरनैंट हटा दें।
बफर ए के साथ वॉश दोहराएं, इसके बाद तीन एक्स फ्लैग-पेप्टाइड के साथ पूर्व ठंडा बफर B.To एल्यूट के साथ दो वॉश करें, टेक्स्ट पांडुलिपि में वर्णित एल्यूशन समाधान तैयार करें और फ्लैग-मोतियों को नीचे स्पिन करें। एक संकीर्ण अंत पिपेट टिप के साथ सुपरनैट को हटा दें और प्रत्येक नमूने में तीन एक्स फ्लैग एल्यूशन समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। कोमल रोटेशन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट ।
फिर 3000 बार जी. सुपरनेट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करने और दो बार एल्यूशन दोहराने पर दो मिनट के लिए मोतियों को नीचे स्पिन करें। फ्लैग इम्यूनोप्रिपिटेशन की दक्षता की जांच करने के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण या चांदी धुंधला के लिए eluents के 5% बचाओ। खींचा eluents को तैयार स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों में स्थानांतरित करें और नमूनों को धीरे से एक से तीन घंटे या रात भर के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
इसके बाद मोतियों को चुंबकीय स्टैंड पर इकट्ठा कर सुपरनिट निकाल दें। प्रति धोने पांच मिनट के लिए कोमल रोटेशन के साथ बफर सी के ५०० माइक्रोलीटर के साथ मोतियों को दो बार धोएं । इसके बाद, बफर डी के 500 माइक्रोलीटर के साथ दो बार मोतियों को धोएं, और दो बार बर्फ-ठंडे पीएनके बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ, चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों का संग्रह करें और वॉश के बीच में सुपरनैंट को हटा दें।
आंशिक आरएनए पाचन करने के लिए, प्रत्येक नमूने में एमएनए समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और भंवर 10 मिनट के लिए थर्मल मिक्सर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। 30 सेकंड के लिए एक चुंबकीय स्टैंड के साथ मोती ले लीजिए और सुपरनैंट को हटा दें। फिर, पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार उन्हें पीएनके-ईडीए बफर, बफर सी और पीएनके बफर से धोएं।
चुंबकीय स्टैंड के साथ मोतियों को इकट्ठा करें और बफर को हटा दें। फिर, सीआईपी रिएक्शन मिक्स जोड़ें और 10 मिनट के लिए थर्मल मिक्सर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों भंवर। बर्फ-ठंडे PNK EDTA बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ मोतियों को दो बार धोएं, इसके बाद बर्फ-ठंडे पीएनके बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ दो वॉश करें।
वॉश के बाद, मोतियों में तीन प्राइम लिंकर लिगेशन मिश्रण के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें तीन घंटे या रात भर के लिए थर्मल मिक्सर के साथ 16 डिग्री सेल्सियस पर भंवर दें। इस प्रयोग के लिए सहयोगी दलों के लिए लिंकर का कुशल बंधन महत्वपूर्ण है । यह सुनिश्चित करने के लिए कभी-कभी प्रतिक्रिया ट्यूब की जांच करें कि ये लिगेशन के दौरान नहीं होते हैं।
इनक्यूबेशन के बाद, पीएनके ईडीए और पीएनके बफ़र्स के साथ वॉश दोहराएं, मोतियों में मिश्रित पीएनके के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें 10 मिनट के लिए थर्मल मिक्सर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर भंवर दें। पीएनके ईडीए और पीएनके बफ़र्स के साथ मोतियों को धोएं, फिर पाठ पांडुलिपि में वर्णित आरएनए अलगाव के साथ आगे बढ़ें। फ्लैग-मध्यस्थता या स्ट्रेप्टाविडिन की तुलना में एक कदम आत्मीयता शुद्धि में मध्यस्थता की गई, फ्लैग-बायोटिन टैंडेम शुद्धि ने अप्रत्यक्ष प्रोटीन आरएनए इंटरैक्शन के संदूषण से बचते हुए लगभग सभी कोर शुद्ध प्रोटीन को हटा दिया।
LIN28 और WDR43, Fbio क्लिप-seq माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था । कुल मिलाकर, LIN28 और WDR43 के लिए क्रमशः लगभग 7.7 मिलियन और 2.2 मिलियन अद्वितीय रीड्स प्राप्त किए गए थे। ट्रैक दृश्यों की तुलना RN45 प्री-आरएनए लोकस में विभिन्न बाध्यकारी पैटर्न दिखाती है।
LIN28, Fbio क्लिप-seq या पहचान द्वारा पूर्व-let7-g आरएनए के GGA जी आकृति पर क्रॉस-लिंक्ड साइटें। इसके अलावा, बाध्यकारी साइटों में समृद्ध आरएनए रूपांकनों, और विभिन्न प्रकार के उत्परिवर्तनों में उत्परिवर्तित न्यूक्लियोटाइड का प्रतिशत निर्धारित किया गया था। यह दिखाता है कि LIN28 जीन न्यूक्लियोटाइड से बांधना पसंद करता है।
खैर, 10:00 बजे, इस प्रोटोकॉल, यह सुनिश्चित करें कि प्रोटीन केवल परिसरों सफलतापूर्वक शुद्ध किया गया बनाने के लिए इम्यूनोप्रिपिक्षा की दक्षता की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
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