Login processing...

JoVE Journal
Genetics

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Genetics

Транскриптом-широкое профилирование белково-РНК-взаимодействий путем перекрестного связывания и иммунопреципиентации при посредничестве FLAG-Biotin Tandem Purification

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Journal (Genetics)

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Journal (Genetics)

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Click here for the English version

Транскриптом-широкое профилирование белково-РНК-взаимодействий путем перекрестного связывания и иммунопреципиентации при посредничестве FLAG-Biotin Tandem Purification

Article DOI: 10.3791/60730-v

May 18th, 2020 •

Xianju Bi^1,2, Xuechun Zhang¹, Xiaohua Shen¹

¹Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Medicine and School of Life Sciences, Tsinghua University, ²Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

May 18th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Здесь мы представляем модифицированный протокол CLIP-seq под ^{названием Fbio}CLIP-seq с очисткой тандема FLAG-biotin для определения целей РНК-связывающих белков (RBPs) в клетках млекопитающих.

Transcript

Только связывающие белки контролируют несколько биологических процессов. Этот метод FLAG-Biotin CLIP-seq, следовательно, глобально профилированного специального и временного расположения РНК и RBPs в клетках млекопитающих. Этот метод позволяет эффективно обнаруживать прямые РНК, связанные с белком, без SDS-PAGE и процедур переноса мембраны.

По сравнению с традиционным CLIP-seq изотопов бесплатно и не требует белка конкретных антител. Начните с покрытия около 3 миллионов эмбриональных клеток мыши STEM в 10-сантиметровой пластине и инкубации их в одночасье. На следующий день удалите среду с помощью вакуума и обработать клетки двумя миллилитров 0,25%трипсина ЭДТА в течение двух минут при комнатной температуре.

Утолить трипсин с четырьмя миллилитров свежей среды MESC, и передать клетки в 15 миллилитров центрифуги трубки. Затем центрифуга их в 300 раз G в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию и удалить супернатант. Приостановить клетки в четыре миллилитров холодного PBS и передать их обратно в 10 сантиметров пластины для перекрестного соединения.

Излучают клетки с 254 нанометровым ультрафиолетовым светом, а затем передают перекрестные клетки в 15 миллилитровую трубку. Спин вниз этой клетки в 300 раз G в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию, а затем удалить супернатант и подышеть клетки с 500 микролитров буфера А подготовлены в соответствии с рукописными указаниями. Перенесите клетки в безрновую трубку 1,5 миллилитров и инкубировать их при четырех градусах Цельсия с мягким вращением в течение 30-60 минут.

Лечить лизате с 30 микролитров DNAse 1 при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем остановите реакцию, добавив четыре микролитера 0,5 млара EDTA. Спин вниз нерастворимые гранулы центрифугирования на 12000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию, и передать супернатант в новый предварительно охлажденный 1,5 миллилитр трубки.

Перенесите лизат клетки на предварительно уравновешенные бусинки FLAG и инкубировать образец при четырех градусах Цельсия во время вращения в течение двух-четырех часов. После инкубации центрифуга бисера в течение двух минут при 3000 раз G и удалить супернатант. Добавить 500 микролитров буфера А в образец, и инкубируется при 4 градусах по Цельсию в течение пяти минут, затем спина вниз бисера и удалить супернатант.

Повторите стирку с Buffer A, а затем два моет с предварительно охлажденной Buffer B.To elute с тремя X FLAG-пептид, подготовить решение элюции, как описано в тексте рукописи и спина вниз FLAG-бусы. Удалите супернатант с узким кончиком пипетки конца и добавьте 200 микролитров раствора 3 X FLAG elution к каждому образцу. Инкубировать образцы в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением.

Затем спина вниз бусы в течение двух минут в 3000 раз G.Transfer супернат в свежую трубку и повторить elution дважды. Сохранить 5% элюентов для западного анализа пятно или окрашивание серебра, чтобы проверить эффективность FLAG иммунопреципиентации. Передача вытащил элюенты подготовлены стрептавидин бусы и повернуть образцы мягко при четырех градусах по Цельсию в течение одного-трех часов или на ночь.

Затем соберите шарики на магнитной подгоке и удалите супернатант. Вымойте бисер дважды с 500 микролитров Buffer C с нежным вращением в течение пяти минут за стирку. Далее, мыть бисер дважды с 500 микролитров buffer D, и дважды с 500 микролитров ледяной буфер PNK, собирая бисер на магнитной подгонке и удаления супернатанта между моет.

Для частичного пищеварения РНК добавьте 100 микролитров раствора MNA к каждому образцу и вихрю при 37 градусах Цельсия с термальным миксером в течение 10 минут. Соберите бисер с магнитным стендом в течение 30 секунд и удалите супернатант. Затем вымойте их буфером PNK-EDTA, буфером Buffer C и PNK в соответствии с рукописными указаниями.

Соберите бисер с магнитной подгоной и удалите буфер. Затем добавьте смесь реакции CIP и вихрь шарики при 37 градусов по Цельсию с термальным миксером в течение 10 минут. Быстро мыть бисер дважды с 500 микролитров ледяной PNK EDTA буфера, а затем две моет с 500 микролитров ледяной буфер PNK.

После моет, добавить 40 микролитров из трех основных связующим лигой смесь с бисером, и вихрь их при 16 градусов по Цельсию с тепловой смеситель в течение трех часов или на ночь. Эффективная перевязка связующих с союзниками имеет решающее значение для этого эксперимента. Проверьте реакцию трубки время от времени, чтобы убедиться, что они не осаждаются во время перевязки.

После инкубации повторите промывки буферами PNK EDTA и PNK, добавьте 40 микролитров PNK, смешанных с бисером, и вихрем их при 37 градусах по Цельсию с термальным миксером в течение 10 минут. Вымойте бисер буферами PNK EDTA и PNK, а затем приступайте к изоляции РНК, как описано в текстовой рукописи. По сравнению с FLAG-опосредованные или стрептавидин опосредовано один шаг сродства очистки, FLAG-Biotin тандем очистки удалены почти все основные очищенные белки, избегая загрязнения косвенных взаимодействий РНК белка.

LIN28 и WDR43, Fbio CLIP-seq были выполнены с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши. В общей сложности для LIN28 и WDR43 было получено около 7,7 млн и 2,2 млн уникальных считых. Сравнение представлений трека показывает различные связывающие шаблоны в локусе RN45 pre-rRNA.

Кросс-связанных сайтов на GGA G мотив до-let7-g РНК LIN28, Fbio CLIP-seq или определены. Кроме того, были определены обогащенные РНК-мотивы в связывающих участках, а также процент мутировавших нуклеотидов в различных типах мутаций. Показывая, что LIN28 предпочитает связываться с нуклеотидом гена.

Ну, в 10:00 вечера, этот протокол, важно, чтобы подтвердить эффективность иммунопреципиентации, чтобы убедиться, что белок только комплексы были очищены успешно.

X

Simple Hit Counter