Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Integrering av ulike synaptiske innganger til nevroner måles best i et preparat som bevarer alle presynaptiske kjerner for naturlig timing og kretsplastisitet, men hjerneskiver som vanligvis bryte mange tilkoblinger. Vi utviklet en modifisert hjerneskive for å etterligne in vivo kretsaktivitet samtidig som in vitro eksperimenteringsevne.
Transcript
Hjerneskiver forsøk tillate avhør av nevronal funksjon med høy elektrisk og timelig oppløsning, men disse skivene vanligvis bryte mange presynaptiske forbindelser. En kileformet skive opprettholder en mer intakt presynaptisk krets. Denne modifiserte hjerneskiven opprettholder en mer komplett in vivo-lignende nevronal krets samtidig som den gir fordelene med in vitro-eksperimentering, for eksempel visuelt veiledede patch clamp opptak, farmakologi og aktivitetsavbildning.
Nøyaktig kile skiver geometri kan estimeres basert på atlas plasseringen av nevronene i kretsen, men integriteten til presynaptic schemata og aksoner bør bestemmes ved hjelp av histologi. Begynn med å bruke et barberblad for å kutte huden midt i skallen fra nesen til baksiden av nakken. Skrell tilbake huden for å eksponere skallen og starter ved bunnen av skallen og fortsetter mot nesen, bruk liten saks for å gjøre et snitt i skallen gjennom midtlinjen.
På lambda sutur, gjør kutt i skallen fra midtlinjen lateralt mot øret på begge sider for å skrelle tilbake skallen for å avsløre hjernen. Starter på rostral slutten, bruk en liten lab slikkepott for å forsiktig løfte hjernen fra skallen for å tillate optiske nerver å bli kuttet. Fortsett å forsiktig arbeide hjernen bakover, utsette ventral overflaten og bruke fine tang for å forsiktig klemme trigeminusnervene nær ventral overflate av hjernestammen for å kutte dem.
Legg preparatet i et glass Petriskål fylt med kald kuttløsning og legg fatet under et disseksjonsmikroskop. Trim ansiktsnervene nær hjernestammen for å eksponere vestibulocochlear nerver. Bruk fine tang til å skyve spissene inn i foraminaen der vestibulocochlear nerven kommer ut av skallen så langt som mulig.
Klem for å bryte nervene på begge sider, og la nerveroten være festet til hjernestammen. Fjern meninges og vaskulatur fra ventral overflate av hjernestammen nær trapeskroppen. Klyp deretter de gjenværende kraniale nervene og bindevevet for å frigjøre hjernen helt fra skallen, og ta vare på å bevare den gjenværende ryggmargen, om mulig.
For å forberede overflaten av hjernen for ligaen til scenen, plasser hjernen ventral side opp og bruk et sløvt verktøy for å forsiktig immobilisere ryggmargen for å stabilisere hjernevevet. Sett inn åpne tang i en ca 20 graders vinkel gjennom hjernen til bunnen av parabolen slik at spissene går ut av hjerneblydens dorsale overflate til den optiske chiasmen og bruk et barberblad til å skjære langs tangen. Deretter forbereder du en en kubikkcentimeter blokk på 4% agar og sprer en liten dråpe lim inn i et rektangel på scenen.
Bruk tang til å løfte hjernen forsiktig og forsiktig dab overflødig væske med kanten av et papirhåndkle. Plasser deretter den blokkerte overflaten på limet slik at ventraloverflaten vender mot bladets retning under kutting og skyv agarblokken forsiktig mot den dorsale overflaten som støtte. For å skaffe kileskiver med cochleanervenroten på den tykke siden og de mediale olivocochlearonronene og den mediale kjernen i trapeskroppen på den tynne siden, plasser den magnetiske platen med den vedlagte hjernen på sceneholderen og plasser holderen i skjærekammeret i en vibratom med hjernens ventrale overflate orientert mot bladet.
Fyll kammeret med iskald skjæreløsning og senk bladet ned i karbagenboblet løsning. Skjær skiver caudal til interesseområdet for å sikre at skivene er symmetriske. Deretter skifter scenen ca 15 grader til den ene siden.
Fortsett å kutte forsiktig til den hørbare nerveroten er nær overflaten på den ene siden, og ansiktsnerven kan ses på overflaten av den andre siden av skiven. Flytt trinnet 15 grader tilbake til den opprinnelige posisjonen og flytt bladet bort fra vevet. Spinn scenebasen 90 grader slik at den laterale kanten av den tynne siden vender mot bladet og senker bladet flere hundre mikrometer før du sakte bringer bladet nær kanten av vevet.
Med bladet trukket litt ned bladet til ønsket tykkelse på den tynne kanten av skiven. Flytt bladet tilbake fra vevet og spinn scenebasen tilbake slik at ventraloverflaten vender mot scenebasen. Lag et kutt for å utpeke rostral overflaten av kileskiven og overføre skiven til en firkantet centimeter stykke grensesnitt papir caudle overflaten ned.
Ansiktsnerven skal være synlig på begge halvkuler av skiven på rostraloverflaten. Flytt deretter skiven til et 35 grader Celsius inkubasjonskammer for å gjenopprette i 30 minutter. For å sette opp kilehæren for elektrofysiologianalyse plasserer du prøven i et opptakskammer som kontinuerlig perfunderes med 35 grader Celsius ACSF og stabiliserer skiven.
Bruk DIC optikk, fokuser på den hørbare nerveroten på den tykke siden av skiven og bruk en mikromanipulator til å flytte den bipolare wolframstimulerende elektroden til den hørbare nerveroten og forsiktig inn i overflaten av vevet. Flytt synsfeltet til den ventrale kjernen i trapeskroppen på den tynne siden og velg en medial olivocochlea neuron som mål for patch clamp elektrofysiologi under epifluorescens ved hjelp av et 561 nanometer utslippsfilter. Fyll en opptakpipette med riktig intern løsning for det foreslåtte eksperimentet og under DIC optikk patch og registrere fra medial olivocochlear neuron i hele cellekonfigurasjonen.
Juster den elektriske stimuleringsalituden til hørselsnerven for å oppnå konsistente postsynaptiske hendelser i den mediale olivocochlearonronnen. Kjør deretter passende stimuleringsprotokoller for å observere fremkalte synaptiske strømmer i mediale olivocochlearononer. Dette kileskiven er designet for å inneholde den hørbare nerveroten og cochleakjernen kontralaterale til de mediale olivocochlearonronene som er rettet mot opptak.
I denne cresyl fiolett farget reseksjonert kile skive cochlea kjernen er til stede i nesten sin fulle rostral-caudal grad. Og hørselsnerven rot observeres inn i cochlea kjernen. I tillegg inneholder kileskiven nevroner av den mediale kjernen i trapeskroppen ipsilateral til mediale olivocochlearononer hvor opptakene utføres.
For å bekrefte den nevronale tilkoblingen i en kile skive presynaptic innganger stimuleres på to måter. Først stimuleres ventral akustisk stria på midtlinjen elektrisk, aktiverer T-stellate aksler direkte og den mediale kjernen i trapeskroppens nevroner via globular buskete celleaksonstimulering og resulterer i postsynaptiske strømmer som måles ved det mediale olivocochlearonronon. Den auditive nerveroten stimuleres deretter til å aktivere hele monaural stigende hjernestammekretser og å fremkalle postsynaptiske responser.
Sammenligning av latensmålene ved første postsynaptiske strøm fremkalt med direkte stimulering av ventral akustisk stria med de som fremkales med auditiv nervestimulering avslører en betydelig lengre ventetid i den hørbare nervestimuleringshendelsen, noe som indikerer synaptisk forsinkelse som følge av den ekstra cochleakjernersynapse aktivert under auditiv nervestimulering. Bruken av anatomiske landemerker og forsiktig manøvrering av magnetplatestadiet er avgjørende for å skape kilehærer med intakte nevronale kretser og pålitelige fremkalte postsynaptiske responser. Denne kutteteknikken gir en plattform for bruk av ekstra in vitro elektrofysiologiverktøy, inkludert kalsium- eller spenningsavbildning, optogenetikk, nevrotransmitter uncaging, og både intracellulær og ekstracellulær farmakologi.
Tags
Nevrovitenskap utgave 162 mediale olivocochlearonroner in vitro skive elektrofysiologi synaptisk integrasjon auditiv nerve auditiv hjernestamme cochleakjerne hemmende nevrotransmisjonRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
