Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In-Nucleus Hi-C i Drosophila celler
Chapters
Summary September 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Genomet är organiserat i kärnrummet i olika strukturer som kan avslöjas genom kromosomkonformationsfångstteknik. Hi-C-metoden i nukleus ger en genomomfattande samling kromatininteraktioner i Drosophila-cellinjer, som genererar kontaktkartor som kan utforskas vid megabasupplösning på begränsningsfragmentnivå.
Transcript
Nucleus Hi-C-protokollen tillåter utforskning av kromosomal bekräftelse med olika upplösning för karakterisering av kromatin loopar, domäner och fack organisera genomet. Detta protokoll ger högupplöst profilering av genomiska interaktioner i olika skalor, vilket ger en mer konsekvent täckning över hela skalan av genomiska avstånd och data med mindre tekniskt brus. Att kombinera detta protokoll med genetisk redigering är en kraftfull strategi för att testa genetiska elements strukturella funktion.
Det kan också tillämpas på karakterisering av strukturella variationer som leder till sjukdom. Kärnan Hi-C protokoll kan tillämpas för att utforska genom organisationen av alla eukaryotic genom. Att göra SDS- och Triton-behandling disaggregerar alla kärnklumpar genom pipetting eftersom aggregat stör enzymatisk reaktionseffektivitet och var noga med att utföra lämpliga kvalitetskontroller före sekvensering.
Börja med att tillsätta metanolfri formaldehyd till en gånger 10 till de sju Schneider's Line 2 Plus Drosophila-cellerna i 17,5 milliliter Schneider medium kompletterat med 10%FBS till en slutlig koncentration på 2%Inkubera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur med blandning var 60: e sekund eller på ett roterande hjul, och tillsätt glycin till en slutlig koncentration av 0,125 molar med blandning. Efter fem minuter vid rumstemperatur och 15 minuter på is, samla cellerna genom centrifugering och försiktigt återanvänd pelleten i 25 milliliter kall PBS och samla cellerna med en annan centrifugation. I slutet av centrifugationen återanvände cellerna i en milliliter iskyllysbuffert för att räkna och justera cellerna till en gång 10 till de sex cellerna per milliliterkoncentration.
Inkubera cellerna på is i 30 minuter, vänd röret varannan minut för att blanda och samla cellerna med en annan centrifugation. Återanvänd pelleten i en milliliter färsk iskall lysbuffert. Efter centrifugering, tvätta lysatet med en milliliter 1,25X begränsningsbuffert.
Centrifug igen för att samla lysatet. Återanvänd pelleten i 360 mikroliter färsk begränsningsbuffert och 11 mikroliter på 10%SDS med noggrann pipetting och inkubera i 45 minuter vid 37 grader Celsius och 7 till 950 varv per minut med tillfällig pipetting. I slutet av inkubationen, stoppa permeabiliseringen med 75 mikroliter icke-joniskt tensid och sätt tillbaka röret till inkubatorn i ytterligare 45 minuter med skakningar vid 950 varv per minut med tillfällig pipetting.
För kromatin matsmältning, tillsätt 200 enheter Mbo1 till röret för en fyra till 16-timmars inkubation vid 37 grader Celsius med rotation. I slutet av inkubationen inaktiverar enzymet med 20 minuters inkubation vid 60 grader Celsius. För att fylla i restriktionsfragmentets överhäng och märka DNA-ändarna med biotin, tillsätt 1,5 mikroliter var och en av 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikroliter 0,4 millimolär biotin dATP, 17,5 mikroliter tris låg EDTA-buffert och 10 mikroliter av fem enheter per mikroliter DNA-polymeras ett stort fragment till röret med noggrann blandning.
Inkubera reaktionen i 75 minuter vid 37 grader Celsius med skakningar vid 700 varv per minut var 10: e sekund i 30 sekunder. I slutet av inkubationen, tillsätt ligationsblandningen till kromatin och justera den till en milliliter slutlig reaktionsvolym med noggrann skonsam blandning och inkubera över natten vid 16 grader Celsius. För att bryta ner provproteinerna, tillsätt 50 mikroliter på 10 milligram per milliliter proteinas K till röret för en två timmars inkubation vid 37 grader Celsius.
I slutet av inkubationen, öka temperaturen till 65 grader Celsius över natten för att vända korslänk provet. Nästa morgon, försämra RNA med 10 mikroliter på 10 milligram per milliliter RNAse A.Efter en timme vid 37 grader Celsius, tillsätt en volym fenolklorid till röret och blanda noggrant genom inversion för att få en homogen vit fas. Efter att dna-medlet fälls ut enligt standardprotokoll kvantifierar du DNA:t med hjälp av ett fluorogent färgämne som selektivt binder till DNA och en fluorometer enligt tillverkarens instruktioner.
För att rena DNA från osmältade och smälta alikvoter, ladda 100 nanogram osmält, smälta och ligaterade prover på en 1,5%agarose gel och leta efter ett utstryk centrerat runt 500 baspar i det smälta provet jämfört med ett högt molekylviktsband för det ligaterade provet. För att verifiera Hi-C-märkningen och ligatureffektiviteten genom förstärkning och matsmältning av en känd interaktion, efter PCR, smälter produkterna med Mbo1, Cla1 eller båda, och kör proverna på en ny 1,5 till 2%gel för att möjliggöra uppskattning av det relativa antalet 3C och Hi-C ligatur korsningar. Efter ultraljudsbehandling av provet för att erhålla 200 till 500 DNA-fragment av basparet, överföra 130 mikroliter med fem mikrogram DNA från varje prov till nya mikrocentrifugrör som innehåller 16 mikroliter 10X ligationsbuffert, två mikroliter på 10 millimolar dATP, fem mikroliter T4 DNA-polymeras och sju mikroliter dubbeldestillerat vatten för en 30-minuters inkubation vid 20 grader Celsius.
I slutet av inkubationen, tillsätt fem mikroliter på 10 millimolar dNTPs, fyra mikroliter av 10X ligationsbuffert, fem mikroliter T4 polynukleotidkinas, en mikroliter DNA-polymeras ett stort fragment och 25 mikroliter dubbeldestillerat vatten till rören för en andra 30-minuters inkubation vid 20 grader Celsius. För att välja fragment mestadels i intervallet 250 till 550 basparstorlek, utför sekventiellt val av solid fas reversibel och mobiliseringsstorlek med 0,6X, sedan 0,9X enligt tillverkarens instruktioner och eluera DNA med 100 mikroliter tris låg EDTA. För biotindragning för varje bibliotek, tvätta 150 mikroliter Streptavidin-länkade magnetiska pärlor två gånger med 400 mikroliter 1X Tween-buffert och rotera proverna i tre minuter på ett roterande hjul.
I slutet av inkubationen, återanvänd pärlor i 300 mikroliter av 2X ingen interpoleringsbuffert och blanda med 300 mikroliter Hi-C-material för en 30-minuters rotation på ett roterande hjul. I slutet av inkubationen, tvätta pärlorna med 400 mikroliter 0,5X interpoleringsbuffert för en tre minuters inkubation vid 55 grader Celsius och 750 varv per minut, följt av två tvättar i 200 mikroliter med 1X begränsningsbuffert per tvätt. Efter den andra tvätten, återanvända pärlor i 100 mikroliter dATP tailing mix för en 30-minuters inkubation vid 37 grader Celsius.
I slutet av inkubationen, återanvända pärlor i 50 mikroliter 1X ligationsbuffert och överför suspensionen till ett nytt rör som innehåller fyra mikroliter förglödgade parade slutadaptrar och två mikroliter T4 ligase. Efter två timmar vid rumstemperatur, ta bort supernaten och tvätta pärlorna två gånger med 400 mikroliter Tween-buffert, tvätta sedan pärlorna en gång med 200 mikroliter utan interpoleringsbuffert och en gång med 100 mikroliter begränsningsbuffert innan du åter avbryter pärlorna i 40 mikroliter 1X begränsningsbuffert. Ett utstryk på 200 till 1 000 baspar observeras när begränsningen med Mbo1 lyckas.
Om ligaturen lyckas observeras ett högmolekylviktsband högst upp på gelén. Matsmältningseffektivitet kan också bekräftas av kvantitativ PCR. En acceptabel matsmältningseffektivitet är 80%eller högre.
Som illustreras kan förstärkningen av en känd mellanklassinteraktion i Hi-C-ligaturprodukter uppskattas genom matsmältningen av PCR-produkten som återvinns vid förstärkningen. En matsmältningseffektivitet på mer än 70%rekommenderas för att undvika att ha en stor andel icke-användbara läsningar för biblioteken efter sekvensering. Antalet PCR-cykler för den slutliga förstärkningen bör vara en cykel mindre än antalet cykler för vilka utstryket är synligt.
Bibliotekets matsmältningsnivå anger överflödet av giltiga Hi-C-par och återspeglar andelen användbara läsningar som kommer att erhållas från biblioteket. Med hjälp av de unika giltiga Hi-C-paren kan grundläggande analys av parfördelningen utföras. Som observerats i detta representativa exempel kan NOTCH-genloken ses tillsammans med arkitektoniska proteiner, domäner ett och två och histonmodifieringar längs locus.
Vid borttagning av regionen som innehåller både CTCF och M1BP DNA-bindande platser, en dramatisk förändring i kromatin kontakter kan observeras. Efter Hi-C-experimentet kan en utföras för att nå en viss uppsättning kontakter, till exempel från promotorregioner. Detta är särskilt användbart vid bedömning av stora genom.
Som visats kan kombinationen av Hi-C-protokollet med genetisk tillsats användas för att bedöma den strukturella och regulatoriska funktionen hos genomiska element.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
