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एक कदम Strep-Tactin राल बीआईएस (sulfosuccinimidyl) के साथ पार से जुड़े Suberate (BS3) पर ट्विन Strep टैग प्रोटीन और उनके परिसरों का शोधन

Biology

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Summary

एक विधि (Strep-Tactin) राल covalently बीआईएस (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) के साथ पार से जुड़े संशोधित streptavidin पर जुड़वां Strep टैग फ्यूजन प्रोटीन और उनके विशिष्ट परिसरों के कुशल शुद्धि के लिए वर्णित है. विधि तेज गति, अच्छा लक्ष्य प्रोटीन वसूली और उच्च शुद्धता के फायदे हैं, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के साथ संगत है.

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Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

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Abstract

एक इंजीनियर streptavidin (Strep-Tactin) ले जाने रेजिन पर Strep टैग फ्यूजन प्रोटीन के संबंध शुद्धीकरण शारीरिक शर्तों के तहत प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तरीका बन गया है. जुड़वां Strep टैग या SIII टैग नामित Strep टैग द्वितीय की दो प्रतियां, जिसमें फ्यूजन प्रोटीन इस प्रकार अधिक कुशल प्रोटीन शुद्धि की अनुमति, केवल एक ही Strep टैग युक्त उन लोगों की तुलना Strep-Tactin के लिए उच्च संबंध का लाभ दिया है. हालांकि, यह लाभ बायोटिन साथ जुड़वां Strep टैग प्रोटीन की क्षालन कम प्रोटीन वसूली के लिए अग्रणी, अपूर्ण हो सकती है कि इस तथ्य के द्वारा ऑफसेट है. वसूली में नाटकीय रूप से सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस) के साथ denaturing क्षालन का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है, लेकिन यह नीचे की ओर प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ परख असंगत बनाने, राल से जारी Strep-Tactin साथ संदूषण नमूना की ओर जाता है. इस सीमा को पार करने के लिए, हम एक विधि Strep-Tactin की जिससे राल मिलकर टेट्रामर विकसित किया हैपहले सहसंयोजक बीआईएस (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) के साथ पार से जोड़ने और जिसके परिणामस्वरूप पार से जुड़े राल तो एक ही बैच शोधन चरण में लक्ष्य प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा स्थिर है. Strep-Tactin contaminating के अभाव मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा डाउनस्ट्रीम प्रोटीन विश्लेषण की अनुमति देता है, जबकि एसडीएस के साथ कुशल क्षालन, अच्छा प्रोटीन वसूली सुनिश्चित करता है. अवधारणा के एक सबूत के रूप में, हम वायरस से संक्रमित एन के नाभिक से VPG समर्थक SIII टैग वायरल प्रोटीन की शुद्धि के लिए यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन BS3 साथ पार से जुड़े Strep-Tactin polymethacrylate राल का उपयोग benthamiana पौधों. एक ही प्रोटोकॉल ब्याज की किसी भी जुड़वां Strep टैग प्रोटीन को शुद्ध और अपनी शारीरिक बंधन भागीदारों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

हाल के वर्षों में, Strep टैग प्रौद्योगिकी प्रोटिओमिक्स और संरचनात्मक जीव विज्ञान सहित जैव चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों में व्यापक रूप से इस्तेमाल हो गया है. एक छोटी Strep टैग पेप्टाइड को पुनः संयोजक प्रोटीन के विलय पर निर्भर करता है जो इस प्रोटीन शुद्धीकरण प्रौद्योगिकी, Strep-Tactin, बेहतर पेप्टाइड बंधन क्षमता के साथ streptavidin की एक अनुवांशिक इंजीनियर संस्करण ले जाने आत्मीयता matrices के आगमन के साथ परिपक्व हो गया है. 1, 2 जुड़वां Strep टैग या SIII टैग, प्रदर्शन पुनः संयोजक प्रोटीन की अधिक कुशल शुद्धि सुनिश्चित करने, केवल एक ही Strep टैग युक्त उन से Strep-Tactin matrices के लिए एक उच्च आत्मीयता और नामित Strep टैग द्वितीय की दो प्रतियां, जिसमें फ्यूजन प्रोटीन उनके संबद्ध बंधन भागीदारों. हालांकि, Strep-Tactin को जुड़वां Strep टैग प्रोटीन का उच्च आत्मीयता भी इसके नकारात्मक पहलू है. अतिरिक्त बायोटिन के साथ प्रोटीन की प्रतियोगी क्षालन लक्ष्य प्रोटीन उपज में कमी आई करने के लिए अग्रणी, अपूर्ण हो सकती है. एक मीटरअयस्क कुशल वैकल्पिक एसडीएस के साथ क्षालन है, लेकिन यह प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ परख असंगत बनाने, राल से जारी Strep-Tactin साथ अवांछित नमूना संदूषण की ओर जाता है. इस पत्र में पहले रासायनिक पार से जोड़ने से Strep-Tactin की राल मिलकर टेट्रामर स्थिर और फिर जिसके परिणामस्वरूप पार से जुड़े राल से दो Strep टैग प्रोटीन और उनके संबद्ध परिसरों elute को एसडीएस का उपयोग करके इस सीमा को पार करने के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है. इस प्रकार, पर्याप्त प्रोटीन उपज है, जिससे जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आगे विश्लेषण की अनुमति, Strep-Tactin साथ नमूना संदूषण के बिना हासिल किया जा सकता है.

विधि एक सतह उजागर SIII टैग 3 या जुड़वां Strep टैग (अमीनो एसिड अनुक्रम WSHPQFEK (GGGS) क्रमश: 3 WSHPQFEK और SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK,) के साथ किसी भी पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन की शुद्धि के लिए उपयुक्त है. प्रोटीन पशु, पौधे या बैक्टीरियल मूल का हो सकता है और कुल सेल या तो से अलग किया जा सकता हैlysate या समृद्ध organelle अंश. एक उदाहरण के रूप में, हम यहाँ PVA संक्रमित निकोटियाना benthamiana पौधों की परमाणु अंश से आलू वायरस ए (PVA) 4 के एक SIII टैग प्रोटीन VPG समर्थक की शुद्धि का वर्णन. पहले से निम्नलिखित संशोधनों के साथ, 5 में वर्णित के रूप में परमाणु अंश पृथक किया गया: कोशिकाओं formaldehyde के साथ इलाज नहीं किया गया, सोडियम butyrate 5 मिमी सोडियम फ्लोराइड के साथ सभी बफ़र्स में प्रतिस्थापित किया गया था, पूरा protease अवरोध PMSF साथ प्रतिस्थापित किया गया था, निकासी में ट्राइटन X-100 एकाग्रता बफर # 2 0.3% करने के लिए उतारा गया (वी / वी) और (निष्कर्षण बफर # 3) सुक्रोज तकिया के माध्यम से centrifugation द्वारा प्राप्त परमाणु गोली पूर्व ठंडा बाध्यकारी बफर के 1.45 मिलीलीटर में resuspended किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए घुमाया SIII टैग चारा प्रोटीन और जुड़े परिसरों (चारा प्रोटीन नमूना) युक्त जिसके परिणामस्वरूप परमाणु निकालने (खंड 2 देखें) नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार संसाधित किया गया था.

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Protocol

1. बीआईएस साथ Strep-Tactin Polymethacrylate राल (sulfosuccinimidyl) के पार से जोड़ने Suberate (BS3)

  1. कमरे के तापमान को BS3 पार linker के 2 मिलीग्राम से युक्त एक मोहरबंद microtube संतुलित करना. चेतावनी: BS3 एक खतरनाक पदार्थ है. सुरक्षा दस्ताने और काले चश्मे पहन लो.
  2. Resuspend Strep-Tactin polymethacrylate राल (100 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच में 50% निलंबन, 1 मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl) द्वारा संक्षिप्त जोरदार झटकों और तुरंत के साथ एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक स्पिन स्तंभ को निलंबन की 600 μl हस्तांतरण अंत काट दिया.
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1500 XG पर अपकेंद्रित्र. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और स्तंभ फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के 450 μl जोड़ें.
  4. पूरी तरह से पीबीएस के साथ Tris बफर की जगह है और पिछले Centrifugation के बाद 8.0 पीएच को समायोजित पीबीएस के 430 μl में राल छोड़ने के लिए पिछले चरण 2 से अधिक बार दोहराएँ.
  5. 100 युक्त एक विंदुक टिप के साथ BS3 साथ microtube की पन्नी पंचर1; ultrapure पानी के एल. धीरे ऊपर और नीचे pipetting और से पानी में BS3 पाउडर भंग और तुरंत स्पिन स्तंभ का हल की 20 μl जोड़ें. पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया में BS3 के अंतिम एकाग्रता ~ 1.2 मिमी है.
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्तंभ घुमाएँ. राल BS3 समाधान के साथ ठीक से मिलाया जाता है कि जाँच करें.
  7. प्रतिक्रिया बुझाने के लिए, 3M Tris-एचसीएल, पीएच 7.5 से 6 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक और 15 मिनट के लिए स्तंभ घुमाएगी.
  8. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1500 XG पर अपकेंद्रित्र. प्रवाह के माध्यम से त्यागें और Tris के 450 μl में पार से जुड़े राल resuspend बीच 20 (TBST) के साथ खारा buffered. Centrifugation दोहराएँ और कदम दो बार धोने. अंतिम चरण में, टीबीएस के 450 μl में राल resuspend.
  9. अंत के साथ एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक ताजा ट्यूब राल निलंबन स्थानांतरण काट दिया. टीबीएस की एक और 450 μl के साथ स्तंभ में छोड़ दिया राल Resuspend और एक ही ट्यूब को हस्तांतरण. दोहराएँ वेंएक बार और ट्यूब के लिए स्तंभ से राल का अधिकतम हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए ई अंतिम चरण.
  10. ट्यूब कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए खड़े हैं और अतिरिक्त टीबीएस हटाने से 600 μl के लिए मात्रा समायोजित करें. राल (सिफारिश) तत्काल इस्तेमाल के लिए तैयार है या ठंड के बिना, 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

2. क्रॉस से जुड़े Strep-Tactin Polymethacrylate राल के लिए ट्विन Strep टैग चारा प्रोटीन और एसोसिएटेड परिसर का बंधन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 17,000 XG पर बाध्यकारी बफर और एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला में चारा प्रोटीन के नमूने की अपकेंद्रित्र 1 मिलीलीटर.
  2. , Strep-Tactin राल को अंतर्जात biotinylated प्रोटीन के बंधन को कम से कम 100 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए avidin जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बारी बारी से करने के लिए
    1. कदम 1.10 से पार से जुड़े राल 4 डिग्री सेल्सियस पर समय की एक विस्तारित अवधि के लिए जमा किया गया है, तो 400 XG लिए पर centrifugation द्वारा राल इकट्ठा4 डिग्री सेल्सियस पर आर 1 मिनट, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और TBST के 1 मिलीलीटर के साथ राल धो लो. Centrifugation दोहराएँ और धोने पहले TBST के साथ और फिर टीबीएस के साथ दो बार, कदम. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और अतिरिक्त टीबीएस निकाल कर मूल मात्रा को समायोजित.
  3. Vortexing द्वारा पार से जुड़े Strep-Tactin राल Resuspend. इसके तत्काल बाद एक कट पिपेट टिप का उपयोग चारा प्रोटीन नमूना युक्त ट्यूब राल निलंबन के 50 μl जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 30 मिनट के लिए बारी बारी से
  4. इंतजार करते हुए, 55 डिग्री सेल्सियस तक thermomixer सेट और 3.1 कदम में उपयोग के लिए क्षालन बफर के 500 μl पहले से गरम.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूर्व ठंडा धोने बफर # 1 के 1 मिलीलीटर के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक रोटेटर पर राल धोने. Centrifugation दोहराएँ और कदम तीन बार धोएं. अंतिम चरण में, धोने बफर # 2 की 250 μl में राल resuspend.
  6. ट्रेडफिन एक ताजा स्पिन स्तंभ के लिए राल निलंबन ansfer. धोने बफर # 2 का एक और 250 μl में ट्यूब में शेष राल Resuspend और एक ही स्तंभ को हस्तांतरण.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक ताजा डॉल्फिन नाक 2 मिलीलीटर ट्यूब स्तंभ हस्तांतरण. नीचे क्षालन कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें.

विशिष्ट प्रोटीन परिसरों की 3. क्षालन

  1. स्पिन स्तंभ के लिए 2.4 कदम से preheated क्षालन बफर के 150 μl जोड़ें.
  2. 1,400 rpm पर मिलाते हुए, 55 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए thermomixer में सेते हैं.
  3. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1500 XG पर अपकेंद्रित्र.
  4. स्तंभ त्यागें और ≤ -20 डिग्री सेल्सियस पर विशुद्ध लक्ष्य प्रोटीन की दुकान
0 "> एक्स "> 550 मिमी 2 "ऊंचाई =" 20 "शैली =" ऊंचाई: 20px; चौड़ाई: 597px; "> क्षालन बफर
फास्फेट बफर खारा (पीबीएस)
ना 2 4 HPO 10 मिमी
के.एच. 2 पीओ 4 2mm
NaCl 137 मिमी
KCl 2.7 मिमी
(धारा 1.4 में 8.0 पीएच) जब तक अन्यथा कहा 7.4 पीएच को समायोजित
Tris (टीबीएस) खारा buffered
Tris-एचसीएल, 7.4 पीएच 50 मिमी
ght = "20" शैली = "ऊंचाई: 20px; चौड़ाई: 299px;"> NaCl 150 मिमी
Tris बीच 20 (TBST) के साथ खारा buffered
Tris-एचसीएल, 7.4 पीएच 50 मिमी
NaCl 150 मिमी
बीच 20 0.1% (v / v)
बाध्यकारी बफर
Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 25 मिमी
NaCl
NAF 5 मिमी
EDTA 0.5 मिमी
ग्लिसरोल 10% (v / v)
PMSF 0.1 मिमी
बफर # 1 धोएं
Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 25 मिमी
NaCl 500 मिमी
NAF टीडी> 5 मिमी
EDTA 0.4 मिमी
Igepal CA-630 0.2% (v / v)
ग्लिसरोल 5% (v / v)
PMSF 0.1 मिमी
बफर # 2 वॉश
Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 25 मिमी
NaCl 150 मिमी
Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 25 मिमी
एसडीएस 1% (w / v)

तालिका 1. वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल बफ़र.

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Representative Results

शुद्धिकरण प्रक्रिया रेखाचित्र के साथ अन्य मौजूदा शोधन तरीकों से जुड़ी समस्याओं का एक प्रतिनिधित्व के साथ, चित्रा 1 में सचित्र है.

चित्रा 1
चित्रा 1. शोधन प्रक्रिया के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कार्यप्रवाह सहसंयोजक पार से जुड़े राल को जुड़वां Strep टैग चारा प्रोटीन और जुड़े परिसरों की बाइंडिंग, BS3 साथ पार से जोड़ने के माध्यम से राल मिलकर Strep-Tactin टेट्रामर का स्थिरीकरण शामिल ,, दूर अनबाउंड प्रोटीन की धुलाई 1% एसडीएस और तरल क्रोमैटोग्राफी अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) द्वारा उनके विश्लेषण के साथ विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन परिसरों की क्षालन denaturing. चारा प्रोटीन में दो लाल क्षेत्रों जुड़वां Strep टैग निरूपित. अन्य शोधन तरीकों की सीमाओं इनसेट में दिखाया गया हैसही पर बॉक्स. वे Strep-Tactin 1% एसडीएस के साथ denaturing क्षालन निम्नलिखित के साथ बायोटिन और नमूना संदूषण के साथ लक्ष्य प्रोटीन की अधूरी क्षालन शामिल हैं.

BS3-पार से जुड़े Strep-Tactin polymethacrylate राल का उपयोग और 1% एसडीएस के साथ क्षालन denaturing SIII टैग प्रोटीन शुद्धि की विशिष्ट परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया. युक्त स्पिन स्तंभ eluate के 10% (15 μl) शुद्ध SIII टैग PVA VPG समर्थक और जुड़े प्रोटीन चांदी धुंधला द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया था. नकारात्मक नियंत्रण लेन में PVA VPG समर्थक को इसी 52 केडीए बैंड की अनुपस्थिति पुल से नीचे की विशिष्टता की पुष्टि की. शेष स्पिन स्तंभ eluate के 40 μl एक केरातिन मुक्त एसडीएस जेल के लिए लागू किया गया है और इसी लेन बाहर काट दिया गया और निहित प्रोटीन trypsin के साथ पचा और तरल क्रोमैटोग्राफी अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) द्वारा विश्लेषण किया गया. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण वायरल शाही सेना depe पहचानVPG समर्थक की बातचीत के साथी के रूप में ndent शाही सेना पोलीमरेज़ (replicase) निब. निब को इसी एकाधिक tryptic पेप्टाइड्स बातचीत की विशिष्टता की पुष्टि, SIII टैग के बिना VPG समर्थक व्यक्त चार नियंत्रण में आत्मीयता शुद्धि और कोई नहीं के सभी चार जैविक प्रतिकृति में पाया गया. निब (59 केडीए) की आणविक भार SIII टैग VPG प्रो (52 केडीए) के करीब है, क्योंकि दो प्रोटीन (चित्रा 2, Arrowhead) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के दौरान एक डबल बैंड के रूप में दिखाई दिया. साथ में ले ली, ऊपर वर्णित परिणाम covalently BS3 साथ पार से जुड़े Strep-Tactin रेजिन पर कि आत्मीयता शुद्धि सफलतापूर्वक जुड़वां Strep टैग प्रोटीन को अलग करने और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उनके शारीरिक बंधन भागीदारों की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता प्रयोगात्मक सबूत प्रदान करते हैं.

चित्रा 2
PVA VPG समर्थक SIII टैग और strep-Tactin polymethacrylate राल पर अपनी बाध्यकारी साथी PVA निब BS3 साथ पार से जुड़े. आंकड़ा पार से जुड़े से eluates की एक चांदी से सना हुआ एसडीएस polyacrylamide जेल से पता चलता है मोती. निब ही नमूना के एक विभाज्य का उपयोग VPG समर्थक के एक बाध्यकारी साथी के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की थी. एक arrowhead ने संकेत दिया, एक डबल बैंड के रूप में विस्थापित: और निब (59 केडीए भविष्यवाणी मेगावाट): PVA VPG प्रो (52 केडीए भविष्यवाणी मेगावाट) SIII टैग. नकारात्मक नियंत्रण (सेंट्रल लेन) वायरस SIII टैग के बिना VPG समर्थक व्यक्त के साथ संक्रमित कोशिकाओं से शुद्धि से मेल खाती है.

चित्रा 3
चित्रा 3. बायोटिन क्षालन Strep-Tactin polymethacrylate राल से PVA VPG समर्थक है SIII टैगअधूरा 1% एसडीएस के साथ क्षालन की तुलना में. आंकड़ा Strep-Tactin मोतियों से eluates के एक विरोधी VPG immunoblot से पता चलता है. मोती 15 मिमी बायोटिन के साथ या 1% एसडीएस के साथ या तो eluted थे. संकेत तीव्रता में अंतर दो क्षालन तकनीक के साथ प्राप्त विभिन्न प्रोटीन की पैदावार को दर्शाता है. नकारात्मक नियंत्रण SIII टैग के बिना VPG समर्थक व्यक्त वायरस से संक्रमित कोशिकाओं से purifications के अनुरूप हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. BS3 साथ पार से जोड़ने सहसंयोजक आंकड़ा गैर पार से जुड़े (बाईं लेन) से एसडीएस eluates की एक चांदी से सना हुआ जेल से पता चलता है. एसडीएस क्षालन दौरान राल से Strep-Tactin की रिहाई से बचाता है और BS3-पार से जुड़े (सही लेन) Strep-Tactin polymethacrylate राल. बाईं लेन में जारी Strep-Tactin की उपस्थिति लेकिन सही लेन में अपनी अनुपस्थिति ध्यान दें.


चित्रा 5. बीआईएस (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) और strep-Tactin में लाइसिन अवशेषों की एप्सिलॉन एमिनो समूहों के साथ इसके पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया की रासायनिक संरचना.

चित्रा 6
पर दो Strep टैग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के चित्रा 6. शोधन गैर पार से जुड़े और strep-Tactin polymethacrylate राल BS3-पार से जुड़े. जुड़वां Strep टैग GFP व्यक्त मानव भ्रूण गुर्दे 293 कोशिकाओं के दो बराबर मात्रा lysed और इसी होना गया है राल BS3 साथ पार से जुड़े किया गया है एक मामले में सिवाय इसके कि और अन्य BS3 में, ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग संसाधित किया गयाएन पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया में पानी के साथ प्रतिस्थापित. आंकड़ा एक चांदी से सना हुआ एसडीएस polyacrylamide जेल और शुद्ध प्रोटीन का विरोधी GFP immunoblot से पता चलता है. प्रोटीन उपज में कुछ कमी रासायनिक पार से जोड़ने को शामिल शुद्धि के तरीकों के लिए निहित है, लेकिन इस वजह से जारी किया Strep-Tactin के अभाव के उच्च नमूना पवित्रता से मुआवजा दिया है कि ध्यान दें.

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Discussion

ऊपर प्रोटोकॉल बायोटिन या मजबूत denaturants शामिल नहीं करता है कि किसी भी उपयुक्त बफर में ब्याज और उसके संबंधित परिसरों से किसी जुड़वां Strep टैग चारा प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल के वर्तमान संस्करण में, बाध्यकारी और वाशिंग उच्च नमक और गैर ईओण डिटर्जेंट की मौजूदगी में अपेक्षाकृत कठोर शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं. इस कम पृष्ठभूमि में यह परिणाम हालांकि, कमजोर प्रोटीन परिसरों इन शर्तों के तहत अलग कर देना हो सकता है. ऐसे कम आत्मीयता परिसरों के संरक्षण, नमक एकाग्रता कम किया जा सकता है और nonionic डिटर्जेंट बफ़र्स बाध्यकारी और धोने से कम या छोड़ा जा सकता है.

जुड़वां Strep टैग प्रणाली का मुख्य लाभ यह है कि इंजीनियर streptavidin भी बैच में लक्ष्य प्रोटीन और उनके परिसरों के कुशल एक कदम शुद्धि की अनुमति (Strep-Tactin) 1, 2, के लिए छोटे (3kDa) मिलकर टैग के उच्च संबंध है मोड. क्योंकि जुड़वां Strep टैग का बंधन मजबूत कीStrep-Tactin के लिए, राल इस तरह के उच्च लक्ष्य प्रोटीन पवित्रता में जो परिणाम उच्च डिटर्जेंट और / या नमक सांद्रता, के रूप में मामूली कठोर परिस्थितियों के तहत धोया जा सकता है. हालांकि, इस तरह के मजबूत बंधन भी अपनी कमियां हैं. यहां तक ​​कि एक भी Strep टैग द्वितीय (अमीनो एसिड अनुक्रम WSHPQFEK) के साथ प्रोटीन के मामले में, राल से प्रतिस्पर्धी क्षालन कभी कभी मुश्किल हो सकता है. उदाहरण के लिए, 10 मिमी के साथ Strep-Tactin polymethacrylate राल से एक Strep (द्वितीय) टैग प्रोटीन kinase, NtCDPK2, का क्षालन एसडीएस नमूना बफर 6 साथ क्षालन denaturing की आवश्यकता होती है, असफल साबित हुई desthiobiotin. समस्या desthiobiotin मजबूत प्रतिस्पर्धा बायोटिन (10 मिमी) और क्षालन जोरदार 7 झटकों के साथ 5 मिनट के लिए बाहर किया गया था के साथ बदल दिया गया था के बाद ही हल किया गया था. Strep-Tactin के लिए उच्च संबंध है जो जुड़वां Strep टैग, के मामले में, लक्ष्य प्रोटीन क्षालन भी 15 मिमी के रूप में उच्च बायोटिन सांद्रता में अपूर्ण हो सकती है. चित्रा 3 में दिखाया गया हैSIII टैग PVA VPG समर्थक का केवल एक छोटा सा अंश 1% एसडीएस के साथ eluted राशि की तुलना में 15 मिमी बायोटिन साथ Strep-Tactin राल से eluted जा सकता है. यह प्रतिस्पर्धी क्षालन की दक्षता की संभावना भी eluted प्रोटीन या प्रोटीन जटिल की प्रकृति पर निर्भर करता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. बड़ा और अधिक हाइड्रोफोबिक प्रोटीन sterically जिससे प्रतिस्पर्धी क्षालन कम कुशल बनाने, Strep-Tactin में बायोटिन बाध्यकारी जेब की पहुंच में बाधा हो सकती है. ऊपर कमियां एसडीएस के साथ क्षालन का उपयोग करके बचा है, लेकिन इस तरह के क्षालन मुख्य रूप से डिटर्जेंट के लिए जोखिम जारी किया Strep-Tactin 8 के साथ राल मिलकर Strep-Tactin tetramers और नमूना संदूषण की हदबंदी की ओर जाता है कि इस तथ्य के आसपास घूमने, अपनी समस्याएं हैं कर रहे हैं. इस एसडीएस 1% से युक्त क्षालन बफर में Strep-Tactin राल की ऊष्मायन के बाद जारी Strep-Tactin की काफी राशि से पता चलता है, जो 4 चित्र (बाईं लेन), में प्रदर्शन किया है. इस तरह के प्रदूषण को अगर अस्वीकार्य हैनमूना आगे LC-MS/MS से विश्लेषण करने की आवश्यकता है.

ऊपर संदूषण समस्या के लिए एक प्रभावी समाधान सहसंयोजक पार से जोड़ने से राल मिलकर Strep-Tactin टेट्रामर 9 का स्थिरीकरण है. इस प्रयोजन के लिए, हम प्रोटीन संरचनाओं 10-13 स्थिर रखने में सफल प्रयोग के इतिहास के साथ एक पानी में घुलनशील, गैर cleavable, homobifunctional amine प्रतिक्रियाशील पार linker BS3 कार्यरत हैं. 5 BS3 की रासायनिक सूत्र से पता चलता है और उसके पार से जोड़ने चित्रा Strep-Tactin में लाइसिन की मुफ्त एप्सिलॉन एमिनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया. राल मिलकर Strep-Tactin टेट्रामर BS3 साथ पार से जोड़ने से स्थिर हो गया था, जब जारी किया Strep-Tactin साथ नमूना संदूषण की समस्या वस्तुतः (चित्रा 4, सही लेन) का सफाया कर दिया गया था. BS3 साथ पार से जोड़ने व्यापक प्रोटीन एकत्रीकरण 14 कारण नहीं है, इसे बनाने, streptavidin में जेब बाध्यकारी बायोटिन की पहुंच को कम नहीं करताStrep टैग संलयन प्रोटीन की शुद्धि के लिए उपयुक्त पार से जुड़े राल. यह जैविक गतिविधि (एंटीबॉडी, आदि) के साथ प्रोटीन की रासायनिक पार से जोड़ने कुछ गतिविधि नुकसान के लिए अग्रणी, दोनों सक्रिय और निष्क्रिय प्रोटीन रचना है कि स्थिर, हालांकि, ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, BS3-पार से जुड़े एंटीबॉडी का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित immunoprecipitation विधि गैर पार से जुड़े एंटीबॉडी 15 के साथ प्राप्त की तुलना में एक कम लक्ष्य प्रोटीन उपज पैदा करता है. फिर भी, जैविक गतिविधि के कुछ नुकसान सुधार नमूना पवित्रता के लिए एक स्वीकार्य व्यापार बंद हो जाता है. हम BS3-पार से जुड़े Strep-Tactin राल के साथ इसी तरह के परिणाम देखा है. पार से जुड़े राल के साथ प्राप्त की कुछ हद तक कम प्रोटीन उपज में काफी सुधार नमूना शुद्धता (चित्रा 6) द्वारा मुआवजा की तुलना में अधिक था.

प्रस्तावित पद्धति का एक और संभावित आवेदन Strep टैग झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि में है solubilizडिटर्जेंट के साथ एड. डिटर्जेंट समाधान में ऐसे हाइड्रोफोबिक प्रोटीन और उनके संबद्ध परिसरों रखने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन उनकी उपस्थिति आत्मीयता राल से जारी Strep-Tactin साथ नमूना संदूषण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस का एक अच्छा उदाहरण प्रोटीन क्रिस्टलीकरण 8 के प्रयोजन के लिए Strep-Tactin मनकों पर NTT1 में एक Strep (द्वितीय) टैग झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि है. क्षालन बफर में डिटर्जेंट laurylamidodimethylpropylaminoxide (LAPAO) की उपस्थिति माला और अवांछित Strep-Tactin क्रिस्टल 8 के बाद के विकास से Strep-Tactin की रिहाई के लिए नेतृत्व किया. सहसंयोजक पार से जोड़ने से राल मिलकर Strep-Tactin टेट्रामर का स्थिरीकरण इस समस्या को दूर करने के लिए एक प्रभावी साधन उपलब्ध करा सकता है.

संक्षेप में, रासायनिक पार से जोड़ने सफलतापूर्वक Strep-Tactin राल से क्षालन denaturing के साथ जुड़े सीमाओं को पार करने के लिए नियोजित किया गया है. इस दृष्टिकोण अच्छा लक्ष्य प्रोटीन फिर से हासिल करने में मददनमूना संदूषण के बिना शुरू covery. प्रस्तावित विधि इस प्रकार मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जुड़वां Strep टैग चारा प्रोटीन की विशिष्ट बंधन भागीदारों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, विधि nucleoprotein reversibly formaldehyde के साथ पार से जुड़े उन सहित परिसरों,, साथ ही डिटर्जेंट के साथ solubilized झिल्ली प्रोटीन को अलग करने और चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है. अंत में, रासायनिक पार से जोड़ने में काफी उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए पार से जुड़े राल संभावित उपयुक्त बनाने, Strep-Tactin राल के भौतिक गुणों को बदल नहीं है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम कृतज्ञता सिनी Miettinen, मिन्ना Pöllänen और Taru Rautavesi की तकनीकी सहायता को स्वीकार करते हैं. हम HEK ध्वनि रिकॉर्डिंग उपकरण उपलब्ध कराने के लिए दो Strep टैग GFP और Pekka Evijärvi व्यक्त 293 कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए Helka Nurkkala धन्यवाद. इस काम फिनलैंड के अकादमी द्वारा वित्त पोषित किया गया, संख्या 138329, 134684 और 258978 अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

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References

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