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한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

Biology

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Summary

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

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Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

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Abstract

설계 스트렙 타비 딘 (연쇄상-Tactin)를 운반하는 수지에 패 혈성 태그가 융합 단백질의 친 화성 정제는 생리 학적 조건에서 단백질 복합체의 분리를위한 널리 사용되는 방법이되고있다. 트윈 패 혈성 태그 또는 SIII 태그를 지정 패 혈성 태그 II의 두 복사본을 포함하는 융합 단백질 따라서보다 효율적인 단백질 정제를 허용, 단 하나의 패 혈성 태그를 포함하는 사람에 비해 연쇄상-Tactin에 대한 높은 친 화성의 장점이 있습니다. 그러나, 이러한 장점은 비오틴과 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질의 용출이 낮은 단백질 복구에 이르는, 불완전 할 수 있다는 사실에 의해 상쇄된다. 복구 극적 도데 실 황산나트륨 (SDS)으로 변성 용출을 사용함으로써 개선 될 수 있지만 하류 단백질체 분석으로 분석 호환되지 수지로부터 방출 연쇄상-Tactin 오염을 샘플링 리드. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 방법 연쇄상-Tactin의 그것에 수지 결합 사량을 개발했습니다제 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 레이트 (BS3)와 가교하고, 생성 된 가교 된 수지를 다음 번의 배치 정제 단계에서 목적 단백질 복합체를 정제하는 데 사용함으로써 안정화된다. 패 혈성-Tactin 오염의 부재는 질량 분석에 의한 하류 단백질 분석을 허용하는 동안 SDS와 효율적인 용출, 좋은 단백질 복구를 보장합니다. 개념의 증거로서, 우리는 바이러스에 감염된 N.의 핵에서 VPG-프로 SIII 태그가 바이러스 성 단백질의 정제를 위해 여기 프로토콜을 설명 BS3으로 가교 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지를 사용한 benthamiana 식물. 동일한 프로토콜은 또한 어떤 트윈 연쇄상-태그 단백질을 정제 및 생리 바인딩 파트너를 특성화하는데 사용될 수있다.

Introduction

최근 몇 년 동안, 패 혈성 태그 기술은 단백질 체학 및 구조 생물학을 포함한 생물 의학 연구의 많은 분야에서 널리 사용되고있다. 짧은 Strep의 태그 펩티드로 재조합 단백질의 융합에 의존이 단백질 정제 기술은, 패 혈성-Tactin 향상된 펩티드 결합능과 스트렙 타비 딘의 유전 공학적 변형을 운반 궁합 행렬들의 출현으로 성숙. 1,2 트윈 패 혈성 태그 또는 SIII 태그, 전시 재조합 단백질을보다 효율적으로 정화를 보장, 단 하나의 패 혈성 태그를 포함하는보다 연쇄상 구균 - Tactin 행렬에 대한 높은 선호도와 지정 패 혈성 태그 II의 두 복사본을 포함하는 융합 단백질 연관된 바인딩 파트너. 그러나, 패 혈성-Tactin에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질의 높은 친화력은 또한 단점이있다. 과량의 비타민 B 복합체와 단백질의 경쟁 용출 대상 단백질 수율 감소로 이어지는, 불완전 할 수 있습니다. M광석 효율적인 대안 SDS와 용출이지만, 프로테오믹스 분석 분석 호환되지 수지에서 발표 연쇄상-Tactin와 바람직하지 않은 샘플의 오염으로 이어집니다. 이 논문은 제 화학적 가교에 의하여 패 혈성-Tactin의 수지 - 결합 사량을 안정화 한 후 얻어진 가교 수지와 트윈 연쇄상-태그 된 단백질과 관련 복합체를 용출 SDS를 사용하여이 제한을 극복하는 기술을 제시한다. 따라서, 충분한 단백질 수율함으로써 질량 분석에 의한 추가 분석을 허용 연쇄상-Tactin 샘플 오염없이 달성 될 수있다.

이 방법은 표면에 노출 된 SIII 태그 3 트윈 패 혈성 태그 (아미노산 서열 WSHPQFEK (GGGS) 각각 3 WSHPQFEK 및 SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK) 어떤 재조합 융합 단백질의 정제를 위해 적당하다. 단백질은 동물, 식물 또는 세균 기원 일 수 있으며 전체 셀 중 하나로부터 단리 될 수있다해물이나 농축 세포 기관의 분수. 예를 들어, 우리는 여기에 PVA에 감염된는 담배 benthamiana 식물의 핵 부분에서 감자 바이러스 A (PVA) 4 SIII 태그가 단백질 VPG-PRO의 정화에 대해 설명합니다. 이전에 다음과 같이 수정하여, 5 바와 같이 핵 분획을 단리 하였다 : 세포를 포름 알데히드로 처리되지 않은, 나트륨 부티레이트를 5 mM의 불소화 나트륨으로 모든 버퍼에 치환하여, 완전 프로테아제 억제제 PMSF로 치환하고, 추출 트리톤 X-100 농도 버퍼 # 2는 0.3 %로 감소 하였다 (V / V) 및 (추출 버퍼 # 3) 자당 쿠션을 통해 원심 분리하여 얻은 핵 펠릿 사전 냉장 바인딩 버퍼의 1.45 ㎖에 재현 탁하고, 4 ℃에서 1.5 시간 동안 회전 SIII-태그 미끼 단백질과 관련된 단지 (미끼 단백질 샘플)를 포함하는 결과 핵 추출물 (섹션 2 참조) 아래에 설명 된 프로토콜에 따라 처리되었습니다.

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Protocol

1. 비스와 패 혈성-Tactin 폴리 메타 크릴 수지 (술포 숙신 이미 딜)의 가교 수베 (BS3)

  1. 실온 BS3 가교제의 2 ㎎을 함유 한 밀봉 된 마이크로 튜브를 평형화. 주의 : BS3는 유해 물질이다. 보호 장갑과 고글을 착용 할 것.
  2. 재현 탁 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지 (100 MM 트리스 - 염산, 산도 8.0의 50 % 현탁액, 1 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨)에 의한 간단한 격렬한 흔들림 즉시에 피펫 팁을 사용하여 스핀 컬럼으로 서스펜션의 600 μl를 전송 끝은 잘라.
  3. 실온에서 30 초 동안 1,500 XG에 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하고 열을 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 450 μl를 추가합니다.
  4. 완전히 PBS로 트리스 버퍼를 교체하고 마지막으로 원심 분리 한 후 pH를 8.0로 조정 PBS 430 μL에 수지를 떠나 이전 단계 2를 번 더 반복합니다.
  5. (100)를 포함하는 피펫 팁 BS3으로 모세관의 호일에 구멍을1, 초순수의 L. 부드럽게 아래로 피펫에 의해 물에 BS3 분말을 녹여 바로 스핀 열 용액 20 μl를 추가합니다. 가교 반응에 BS3의 최종 농도는 ~ 1.2 ㎜이다.
  6. 실온에서 30 분 동안 열을 돌립니다. 수지가 BS3 솔루션을 적절하게 혼합되어 있는지 확인합니다.
  7. 반응을 해소하기 위해, 3M 트리스 - 염산, 산도 7.5의 10 μl를 추가하고 실온에서 또 다른 15 분 동안 열을 돌립니다.
  8. 실온에서 30 초 동안 1,500 XG에 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기 및 트리스 450 μL의 가교 수지를 재현 탁은 트윈 20 (TBST)와 완충 식염수. 원심 분리를 반복하고 단계를 두 번 더 씻는다. 마지막 단계에서, TBS 450 μL에 재현 탁 수지.
  9. 끝으로 피펫 팁을 사용하여 새로운 튜브에 수지 현탁액을 전송 차단. TBS의 또 다른 450 μL와 컬럼에 남아있는 수지를 재현 탁하고 같은 튜브에 전송할 수 있습니다. 반복 일한 번 더 튜브에 열에서 수지의 최대 전송을 보장하기 위해 전자 마지막 단계.
  10. 관을 실온에서 10 분간 방치하고 과량의 TBS를 제거하여 600 μL로 볼륨을 조절하자. 수지 (권장) 즉시 사용할 준비가 또는 냉동하지 않고, 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. 교차 연결된 연쇄상-Tactin 폴리 메타 크릴 레이트 수지에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 미끼 단백질 및 관련 단지의 바인딩

  1. 4 ° C에서 10 분 동안 17,000 XG에서 버퍼를 결합하고 새로운 튜브에 뜨는을 전송의 미끼 단백질 시료의 원심 분리기 1 ML.
  2. , 패 혈성-Tactin 수지에 내인성 바이오틴 단백질의 결합을 최소화 100 μg / ML의 최종 농도에 아비딘을 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 회전하려면
    1. 단계 1.10에서 가교 수지는 4 ° C에서 장기간 보관 한 경우에, FO 400 XG에서 원심 분리에 의해 수지를 상환4 ° C에서 R 1 분, 상층 액을 버리고 TBST 1 ㎖​​로 수지를 세척한다. 원심 분리를 반복 세척 먼저 TBST로 다음 TBS와 두 번 더, 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 1 분 400 XG에 튜브를 원심 분리기 및 초과 TBS를 제거하여 원래 볼륨을 조정합니다.
  3. 볼 텍싱에 의해 가교 된 패 혈성-Tactin 수지에 resuspend. 즉시 컷 피펫 팁을 사용하여 미끼 단백질 샘플이 들어있는 튜브에 수지 현탁액의 50 μl를 추가하고 4 ℃에서 또 다른 30 ​​분 동안 회전
  4. 기다리는 동안, 55 ° C에 thermomixer을 설정하고 단계 3.1에서 사용하기 위해 용출 버퍼 500 μl를 예열.
  5. 4 ℃에서 1 분 400 XG에 원심 분리기 뜨는을 취소하고 미리 냉각 세척 버퍼 1 중 1 ㎖를 4 ° C에서 5 분 동안 회전에 수지를 씻어. 원심 분리를 반복하고 단계를 세 번 씻는다. 마지막 단계에서, 세척 버퍼 # 2 250 μL의 수지를 재현 탁.
  6. TR 신선한 스핀 열 수지 현탁액을 ansfer. 세척 버퍼 # 2의 또 다른 250 μL의 튜브에 남아있는 수지를 재현 탁하고 같은 C 럼에 전송할 수 있습니다.
  7. 4 ° C에서 3 분 400 XG에 원심 분리기, 흐름을 통해 폐기하고 신선한 돌고래 코 2 ㎖ 튜브에 열을 전송합니다. 아래의 용출 단계로 바로 진행합니다.

특정 단백질 복합체의 3. 용출

  1. 스핀 컬럼에 2.4 단계에서 예열 된 용출 버퍼 150 μl를 추가합니다.
  2. 1,400 rpm으로 흔들어, 55 ° C에서 5 분 thermomixer에 품어.
  3. 실온에서 1 분 1,500 XG에 원심 분리기.
  4. 열을 버리고 ≤ -20 ℃에서 정제 된 표적 단백질을 저장
0 "> X; "> 550 밀리미터 2 "높이 ="20 "스타일 ="높이 : 20px의 폭 : 597px; "> 용출 버퍼
인산염 완충 생리 식염수 (PBS)
2 HPO 4 10 mM의
KH 2 PO 4 2mM의
염화나트륨 137 밀리
의 KCl 2.7 mM의
(섹션 1.4의 pH 8.0) 달리 명시되지 않는 pH는 7.4로 조정
트리스 (TBS)를 완충 식염수
트리스 - 염산, pH 7.4의 50 mM의
GHT = "20"스타일 = "높이 : 20px의 폭 : 299px;"> 염화나트륨 150 밀리미터
트리스는 트윈 20 (TBST)와 완충 식염수
트리스 - 염산, pH 7.4의 50 mM의
염화나트륨 150 밀리미터
트윈 20 0.1 % (V / V)
바인딩 버퍼
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
염화나트륨
불화 나트륨 5 mM의
EDTA 0.5 ㎜
글리세린 10 % (V / V)
PMSF 0.1 ㎜
버퍼 # 1을 씻으
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
염화나트륨 500 밀리미터
불화 나트륨 TD> 5 mM의
EDTA 0.4 ㎜
이게 팔 CA-630 0.2 % (V / V)
글리세린 5 % (V / V)
PMSF 0.1 ㎜
버퍼 # 2를 세척
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
염화나트륨 150 밀리미터
트리스 - 염산, pH를 8.0 25 mM의
SDS 1 % (W / V)

표 1. 본 연구에 사용 된 버퍼.

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Representative Results

정화 절차를 개략적으로 서로 다른 기존의 정제 방법과 관련된 문제의 표현과 함께,도 1에 도시되어있다.

그림 1
그림 1. 정화 절차의 도식 표현. 워크 플로는 공유가 가교 수지에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 미끼 단백질과 연관된 복합체의 결합, BS3으로 가교를 통해 수지 결합 패 혈성-Tactin의 사량의 안정화를 포함 ,, 멀리 언 바운드 단백질의 세척 1 % SDS 및 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석기 (LC-MS/MS)에 의해 자신의 분석과 구체적으로 결합 단백질 단지의 용출을 변성. 미끼 단백질에 두 개의 빨간색 분야는 트윈 Strep의 태그를 나타냅니다. 다른 정제 방법의 제한은 삽입에 표시됩니다오른쪽에있는 상자. 그들은 연쇄상-Tactin 1 % SDS와 변성 용출을 다음과 비오틴 및 샘플 오염과 표적 단백질의 완전 용출이 (가) 있습니다.

BS3-가교 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지를 사용하고 1 % SDS로 용출 변성 SIII-태깅 된 단백질 정제의 전형적인 결과를도 2에 나타낸다. 함유 스핀 컬럼 용출액을 10 % (15 μL)으로 정제 SIII-태그 PVA VPG-Pro와 연관된 단백질은 실버 염색 한 다음 SDS-PAGE로 분석 하였다. 음성 대조군 차선 PVA VPG-PRO에 대응 52 kDa의 밴드의 부재는 풀다운의 특이성을 확인했다. 나머지 스핀 컬럼 용출액을 40 μL는 각질없는 SDS 겔에 적용하고, 해당 차선은 잘라 내고 및 포함 된 단백질은 트립신 소화 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석기 (LC-MS/MS)로 분석 하였다. 질량 분광 분석은 바이러스 성 RNA-다 릅니다 식별VPG-PRO의 상호 작용 파트너로 ndent RNA 중합 효소 (replicase) 펜촉. 펜촉에 해당하는 다수의 트립 틱 펩타이드의 상호 작용의 특이성을 확인, SIII 태그없이 VPG-프로를 표현하는 네 개의 컨트롤의 친화력 정화 및 아무도의 네 생물은 복제에서 검출되었다. 펜촉 (59 kDa의)의 분자량이 SIII-태그 VPG-PRO (52 kDa의)에 가까운 때문에, 두 단백질 (그림 2, 화살촉) SDS 페이지 분석에서 이중 밴드로 나타났다. 종합적으로, 상기 결과는 공유 BS3으로 가교 패 혈성-Tactin 수지에 그 친 화성 정제는 성공적 트윈 연쇄상-태그 된 단백질을 분리 및 질량 분석법에 의해 그들의 생리적 바인딩 파트너를 식별하기 위해 사용될 수있다 실험적 증거를 제공한다.

그림 2
PVA VPG-프로 SIII-태그 및 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지에의 바인딩 파트너 PVA 펜촉 BS3으로 가교. 그림은 가교에서 용출액의 실버 스테인드 SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤을 보여줍니다 구슬. 펜촉은 동일한 샘플의 분취 량을 사용하여 VPG-프로의 바인딩 파트너로 질량 분석에 의해 확인되었다. 화살촉으로 표시, 이중 밴드로 마이그레이션 : 펜 끝 (59 kDa의 예측 MW) : PVA VPG-PRO (52 kDa의 예측 MW)이 SIII-태그. 음성 대조군 (중앙 차선) 바이러스가 SIII 태그없이 VPG-프로 표현에 감염된 세포에서 정화에 해당합니다.

그림 3
그림 3. 비오틴 용출 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지에서 PVA VPG-Pro는 SIII-태그불완전한 1 % SDS와 용출에 비해. 그림은 패 혈성-Tactin 비즈에서 용출액의 방지 VPG의 면역 블롯을 보여줍니다. 구슬은 15 mM의 비오틴 또는 1 % SDS와 하나 용출되었다. 신호 세기의 차이가이 용출 기술로 얻은 다른 단백질 수율을 반영한다. 음성 대조군은 SIII 태그없이 VPG-프로를 표현하는 바이러스에 감염된 세포에서 않는 정화에 해당합니다.

그림 4
그림 4. BS3으로 가교 공유 결합은 그림이 아닌 가교 (왼쪽 차선)에서 SDS의 용출액의 실버 묻은 젤을 보여줍니다. SDS 용출하는 동안 수지에서 패 혈성-Tactin의 방출을 방지하고 BS3-가교 (오른쪽 차선) 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지. 왼쪽 차선에 출시 패 혈성-Tactin 존재하지만, 오른쪽 차선에있는 그것의 부재를합니다.


도 5. 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 레이트 (BS3) 및 패 혈성-Tactin있는 리신 잔기의 입실론 아미노기와의 가교 반응의 화학 구조.

그림 6
에 트윈 패 혈성 태그 된 녹색 형광 단백질 (GFP)의 그림 6. 정화 비 가교 및 패 혈성-Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지를 BS3-가교. 트윈 연쇄상 구균 - 태그 GFP를 발현하는 인간 배아 신장 293 세포의 두 개의 동일한 양 용해와 마찬가지로 수있다 수지 BS3으로 가교 한 내용 일 경우의 것을 제외하고, 다른 BS3, 상기 프로토콜을 사용하여 처리 하였다EN은 가교 반응에 물로 치환. 이 그림은 염색 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 정제 단백질의 안티 GFP 면역 블롯을 보여줍니다. 단백질 수율에 약간의 감소가 화학적 가교 결합을 포함하는 정제 방법에 내재되어 있지만,이 때문에 출시 패 혈성-Tactin의 부재로 높은 샘플의 순도에 의해 보상합니다.

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Discussion

상기 프로토콜은 비오틴 또는 강한 변성제를 포함하지 않는 임의의 적절한 버퍼에 대한 관심 및 관련 착체의 트윈-Strep의 태그 미끼 단백질을 정제하는데 사용될 수있다. 프로토콜의 현재 버전에서, 결합 및 세척이 높은 염과 비 이온 세제의 존재하에 비교적 엄격한 조건하에 수행된다. 이 적은 배경을 초래하지만, 깨지기 쉬운 단백질 복합체는 이러한 조건에서 해리 수 있습니다. 이러한 낮은 친화 단지를 보존하기 위해 소금 농도가 저하 될 수 있고, 비이 온성 세제 버퍼를 바인딩 및 세척에서 감소 또는 생략 할 수있다.

트윈 Strep의 태그 시스템의 가장 큰 장점은 설계 스트렙 타비 딘도 일괄 처리에서 표적 단백질 및 그 복합체를 효율적으로 한 단계 정화를 허용 (연쇄상 구균 - Tactin) 1, 2,에있는 작은 (3kDa) 탠덤 태그의 높은 궁합 모드. 때문에 트윈 패 혈성 태그의 강한 바인딩패 혈성-Tactin으로, 수지는 높은 표적 단백질 순도 결과 높은 세제 및 / 또는 염 농도, 적당히 엄격한 조건 하에서 세척 될 수있다. 그러나, 이러한 강력한 결합은 또한 단점이 있습니다. 심지어 단일 Strep의 태그 II (아미노산 서열 WSHPQFEK)과 단백질의 경우, 수지와 경쟁적 용리 때때로 어려울 수있다. 예를 들어, 10 mm의 연쇄상 구균 - Tactin의 폴리 메타 크릴 레이트 수지에서 연쇄상 구균 (II) - 태그 단백질 키나제, NtCDPK2의 용출 SDS 샘플 버퍼 6 용출 변성 필요 실패한 것으로 판명 desthiobiotin. 문제는 desthiobiotin가 강한 경쟁 비오틴 (10 MM) 및 용출이 활발한 7을 흔들면서 5 분 동안 실시 하였다로 교체 한 후에 만 해결되었습니다. 패 혈성-Tactin 대한 높은 친 화성을 가지고 트윈 연쇄상-태그의 경우, 표적 단백질의 용출도 15 밀리미터만큼 높은 비오틴 농도에서 불완전 할 수있다. ,도 3에 나타낸 바와 같이SIII-태그 된 PVA VPG-PRO의 단지 작은 분획은 1 % SDS로 용리 량에 비해 15 mM의 비오틴과 스트렙토-Tactin 수지로부터 용리 될 수있다. 이는 경쟁 용출 효율 가능성도 용출 단백질 또는 단백질 복합체의 특성에 의존한다는 것을주의하는 것이 중요하다. 더 크고 더 소수성 단백질은 입체적으로하여 경쟁 용출이 덜 효율적 만들기, 패 혈성-Tactin의 바이오틴 결합 포켓의 접근성을 방해 할 수 있습니다. 위의 단점은 SDS와 용출을 사용하여 피할 수 있지만, 이러한 용출은 주로 세제에 노출이 발표 연쇄상-Tactin 8 수지 결합 패 혈성-Tactin의 테트라 및 샘플 오염의 해리 리드 사실 주위를 맴도는, 자신의 문제가있다. 이는 1 % SDS를 함유하는 용출 버퍼 패 혈성-Tactin 수지의 인큐베이션 후에 발매 연쇄상-Tactin의 상당량을 도시하는도 4 (왼쪽 차선)에서 설명된다. 이러한 오염은 할 수 없을 경우샘플은 또한 LC-MS/MS에 의해 분석 될 필요가있다.

상기 오염 문제에 대한 효과적인 해결책은 공유 결합 가교에 의해 수지 - 결합-Strep의 Tactin 량체 (9)의 안정화이다. 이 목적을 위해, 우리는 단백질 구조보기 10-13 안정화 성공적인 사용 이력과 수용성, 비 분해성, 호모이 기능성 아민 반응성 가교제 BS3을 채용. 5 BS3의 화학식을 도시하고 그 가교 도표 패 혈성-Tactin 라이신 무료 엡실론 아미노 그룹과 반응. 수지 결합 패 혈성-Tactin 량체가 BS3으로 가교에 의해 안정화 될 때 발표 연쇄상-Tactin 샘플 오염의 문제는 거의 (그림 4, 오른쪽 차선)를 제거 하였다. BS3와 가교 결합이 풍부한 단백질 응집 (14)가 발생하지 않기 때문에, 제작, 스트렙 타비 딘에 포켓 바인딩 비오틴의 편의를 감소시키지패 혈성-태그 된 융합 단백질의 정제에 적합한 가교 결합 된 수지. 이는 생물학적 활성 (항체 등)와 함께 단백질의 화학적 가교 일부 활성 손실로 이어지는 두 활성 및 비활성 단백질 입체 형태를 안정화 있다는 점에 유의해야한다. 예를 들어, BS3-가교 된 항체를 사용하여 잘 확립 된 면역 침전 방법은 비 - 가교 된 항체 (15)에 의한 것에 비해 낮은 목적 단백질의 수율을 생성한다. 그럼에도 불구하고, 생물학적 활성의 일부 손실이 개선 된 샘플 순도 허용 트레이드 오프로 간주됩니다. 우리는 BS3-가교 패 혈성-Tactin 수지와 유사한 결과를 관찰했다. 가교 수지를 얻을 다소 낮은 단백질 수율이 크게 향상된 샘플 순도 (그림 6)에 의해 보상보다 더 많은이었다.

제안 된 방법의 또 다른 잠재적 인 응용 프로그램은 패 혈성 태그가 막 단백질의 정제에 solubiliz세제 에드. 세제 용액에 소수성 단백질 및 관련 단지를 유지하기위한 필수적입니다, 그러나 그들의 존재는 친 화성 수지를 발표 연쇄상-Tactin 샘플 오염으로 이어질 수 있습니다. 이것의 좋은 예는 단백질 결정화 (8)의 목적으로 패 혈성-Tactin 구슬에 NTT1에서 연쇄상 구균 (II) - 태그 막 단백질의 정제입니다. 용출 버퍼의 세제 laurylamidodimethylpropylaminoxide (LAPAO)의 존재는 구슬과 원하지 않는 패 혈성-Tactin 결정 8 이후의 성장에서 패 혈성-Tactin의 출시되었다. 공유 결합 가교에 의해 수지 - 결합-Strep의 Tactin 량체의 안정화는이 문제를 극복하는 효과적인 방법을 제공 할 수있다.

요약하면, 화학적 가교 결합이 성공적-Strep의 Tactin 수지로부터 용출 변성과 관련된 한계를 극복하기 위해 사용되어왔다. 이 방법은 좋은 표적 단백질을 재 달성 도왔다샘플 오염을 도입하지 않고 covery. 제안 된 방법은, 따라서 질량 분광기 트윈-Strep의 태그 미끼 단백질의 특이 적 결합 파트너를 식별하는 데 사용될 수있다. 또한, 상기 방법은 핵 단백질 가역적 포름 알데히드 가교 포함한 착물뿐만 아니라 세제 가용화 막 단백질을 분리 및 특성화에 적용될 수있다. 최종적으로, 화학적 가교 결합이 상당히 높은 처리량을 필요로하는 애플리케이션을위한 가교 수지는 잠재적으로 적합하다 Tactin-Strep의 수지의 물리적 특성을 변경하지 않는다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는 기꺼이 시니 Miettinen, 미나 Pöllänen 및 한인 Rautavesi의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 HEK에게 녹음 장비를 제공하는 트윈 연쇄상 구균 - 태그 GFP 및 페카 Evijärvi을 표현하는 293 세포를 제공 헬카 Nurkkala 감사합니다. 이 작품은 핀란드의 아카데미에 의해 투자되었다, 번호 138329, 134684 및 258978을 부여합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

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References

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