Author Produced

Один шаг Очистка Твин-Стрептококковое-меченых белков и их комплексов на Стрептококковое-Tactin Смола, сшитые с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Описан способ эффективного очищения твин-Strep-меченых гибридных белков и их специфических комплексов на модифицированной стрептавидином (Strep-Tactin) смолу, ковалентно сшитый с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3). Способ имеет преимущества высокой скорости, хорошее восстановление белка-мишени и высокой степенью чистоты, и совместим с последующим анализом методом масс-спектрометрии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Affinity очистка Стрептококковое метками слитых белков на смол, несущих инженерии стрептавидин (Стрептококковое-Tactin) стал широко используемым методом для выделения белковых комплексов в физиологических условиях. Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной-Strep-теги или SIII-тег, имеют то преимущество, более высокое сродство к Strep-Tactin по сравнению с те, которые содержат только один Strep-тег, что позволяет более эффективную очистку белка. Однако это преимущество компенсируется тем, что вымывание твин-Стрептококковое-меченых белков с биотин может быть неполной, что приводит к низкой восстановления белка. Восстановление может быть значительно улучшена с помощью денатурирующего элюирование с додецилсульфатом натрия (SDS), но это приводит к образцу заражение Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с последующей протеомного анализа. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали метод, посредством смолы в сочетании тетрамерное из Strep-Tactinсначала стабилизированы ковалентной сшивки с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3) и полученную сшитый полимер затем использовать для очистки целевых комплексов белков в одной стадии очистки пакета. Эффективное элюирование SDS обеспечивает хорошее восстановление белка, а отсутствие загрязнения Strep-Tactin позволяет потоку анализа белков методом масс-спектрометрии. Как доказательство концепции, мы описываем здесь протокол для очистки SIII-меченого вирусного белка ВПГ-Pro из ядер инфицированных вирусом N. benthamiana растения, использующие полиметакрилатные смолы Стрептококковое-Tactin сшитый с БС3. То же протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченый белок, представляющий интерес и характеризуют его физиологических партнеров по связыванию.

Introduction

В последние годы технология Стрептококковое-тег стал широко используемым во многих областях биомедицинских исследований, в том числе протеомики и структурной биологии. Эта технология очистки белка, которая опирается на слияние рекомбинантных белков на короткий пептид Стрептококковое-тега, созрел с появлением сродства матриц, несущих Strep-Tactin, генетически модифицированного варианта стрептавидином с улучшенной пептид-связывающей способности. 1, 2 Гибридные белки, содержащие две копии Strep-тега II, обозначенные двойной Стрептококковое-теги или SIII-тег, проявляют высокое сродство к Стрептококковое-Tactin матриц, чем те, которые содержат только один Strep-тег, обеспечивая более эффективную очистку рекомбинантных белков и связанные с ними связывающие партнеры. Тем не менее, более высокое сродство твин-Стрептококковое-меченых белков Strep-Tactin также имеет свою оборотную сторону. Конкурентная вымывание таких белков с избыточным биотина может быть неполным, что приводит к снижению выход белка целевой. Мруда эффективной альтернативой является элюирование SDS, но это приводит к нежелательному загрязнения образца с Strep-Tactin выпущенный из смолы, что делает анализ несовместимы с протеомного анализа. Эта статья представляет собой технику, чтобы преодолеть это ограничение, сначала стабилизации смолы связью тетрамер стрептококкового-Tactin с помощью химической сшивки, а затем с помощью SDS для элюирования твин-Стрептококковое-тегом белки и связанные с ними комплексы из полученного сшитого полимера. Таким образом, достаточно выход белка может быть достигнуто без загрязнения образца с Strep-Tactin, тем самым позволяя дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии.

Метод подходит для очистки любого рекомбинантного гибридного белка с поверхности, подвергшихся воздействию SIII-тега 3 или двумя-Strep-тега (последовательность аминокислот WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK и SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, соответственно). Белок может быть животного, растительного или бактериального происхождения и может быть выделен из клеток либо общийлизат или обогащенный органелл фракция. В качестве примера, мы описываем здесь очищение в SIII с метками белка ВПГ-Профи Картофель Virus A (ПВС) 4 от ядерной фракции ПВА-инфицированных Nicotiana benthamiana растений. Ядерный фракцию выделяли, как описано ранее 5, со следующими изменениями: клетки не были обработаны формальдегидом, бутират натрия замещенных во всех буферов 5 мМ фторида натрия, в комплекте ингибитор протеазы был замещен PMSF, Тритон Х-100 в концентрации добычи буфер # 2 был снижен до 0,3% (объем / объем) и ядерный осадок получали центрифугированием через сахарозы (экстракционный буфер # 3) ресуспендировали в 1,45 мл предварительно охлажденной буфером для связывания и вращают в течение 1,5 часов при 4 ° С. Полученную ядерный экстракт, содержащий SIII-меченого белка приманки и связанные комплексы (примеры приманка белка) обрабатывают в соответствии с протоколом, описанным ниже (см. раздел 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сшивка Strep-Tactin полиметакрилатные Ресин с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3)

  1. Равновесие один запечатанный микропробирок, содержащий 2 мг BS3 сшивающего агента до комнатной температуры. ВНИМАНИЕ: BS3 является опасным веществом. Носите защитные перчатки и очки.
  2. Ресуспендируют Strep-Tactin полиметакрилат смола (50%-ная суспензия в 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ EDTA; 150 мМ NaCl) при кратковременном энергичного встряхивания и немедленно передать 600 мкл суспензии на ротационную колонку с использованием пипетки с конец отрезать.
  3. Центрифуге при 1500 х г в течение 30 сек при комнатной температуре. Отменить проточные и добавить 450 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в колонну.
  4. Повторите предыдущий шаг 2 несколько раз, чтобы полностью заменить Трис буфер PBS и оставить смолы в 430 мкл PBS доводили до 8,0 после последнего центрифугирования.
  5. Прокол фольгу микропробирок с БС3 с кончика пипетки, содержащей 1001; л сверхчистой воды. Растворить BS3 порошок в воде, осторожно пипеткой вверх и вниз и сразу же добавить 20 мкл раствора в колонну спина. Конечная концентрация BS3 в сшивающего реакции составляет ~ 1,2 мм.
  6. Поверните колонку в течение 30 мин при комнатной температуре. Убедитесь, что смолу смешивают с надлежащим BS3 раствора.
  7. Для гашения реакции, добавляют 6 мкл 3 М Трис-HCl, рН 7,5, и вращать колонну в течение еще 15 мин при комнатной температуре.
  8. Центрифуге при 1500 х г в течение 30 сек при комнатной температуре. Отменить проточные и ресуспендируют сшитый полимер в 450 мкл забуференным трис физиологическим раствором с Tween 20 (TBST). Повторите центрифугирования и мыть шаги еще два раза. На последнем шаге, ресуспендируют смолы в 450 мкл TBS.
  9. Передача смолы суспензии в свежую пробирку с помощью пипетки с конца отрезаны. Ресуспендируют смолы слева в столбце с еще 450 мкл TBS и трансфер в той же пробирке. Повторите йэ последний шаг еще раз, чтобы обеспечить максимальную передачу смолы из колонки к трубе.
  10. Оставьте пробирку в течение 10 мин при комнатной температуре и регулировать громкость в 600 мкл путем удаления избытка TBS. Смола готовы к немедленному использованию (рекомендуется) или можно хранить при температуре 4 ° С, без замораживания.

2. Связывание Твин-Стрептококковое-меткой Bait белка и связанного комплексов в сшитом Стрептококковое-Tactin полиметакрилатные Ресин

  1. Центрифуга 1 мл образца приманка белка в буфере для связывания при 17000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и передачи супернатант в новую пробирку.
  2. Чтобы свести к минимуму связывание эндогенных биотинилированных белков в смоле Strep-Tactin, добавьте авидин в конечной концентрации 100 мкг / мл и вращаться в течение 15 мин при 4 ° С.
    1. Если сшитый смола с шагом 1,10 был сохранен в течение длительного периода времени при 4 ° С, собирают смолу центрифугированием при 400 х г FOR 1 мин при 4 ° С, отбросить супернатант и мыть смолы 1 мл TBST. Повторите центрифугирования и мыть шаги еще два раза, сначала с TBST и затем с TBS. Центрифуга трубки при 400 х г в течение 1 мин при 4 ° С и отрегулировать до первоначального объема путем удаления избытка TBS.
  3. Ресуспендируют сшитый Стрептококковое-Tactin смолы путем встряхивания. Сразу же добавить 50 мкл суспензии смолы в пробирку, содержащую образец приманка белка с использованием наконечника пипетки вырезать и вращать течение еще 30 мин при 4 ° С.
  4. Ожидая, установите Thermomixer до 55 ° С и подогрева 500 мкл буфера для элюции для использования на стадии 3.1.
  5. Центрифуга при 400 мкг в течение 1 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и мыть смолы на ротатора в течение 5 мин при 4 ° С с 1 мл предварительно охлажденной промывочный буфер № 1. Повторите центрифугирования и мыть шаги три раза. На последнем шаге, ресуспендируйте смолы в 250 мкл промывочного буфера # 2.
  6. Тр ansfer смолы суспензии свежей колонке спина. Ресуспендируют смолу, оставшуюся в пробирке в еще 250 мкл промывочного буфера # 2 и передавать в том же столбце.
  7. Центрифуга при 400 мкг в течение 3 мин при 4 ° С, отбросить проточные и передавать столбец к новому дельфин-нос 2 мл трубки. Немедленно приступить к стадии элюирования ниже.

3. Элюцию специфический белок комплексов

  1. Добавить 150 мкл элюирующего буфера предварительно разогретой с шагом 2,4 в колонну спина.
  2. Выдержите в термомиксере в течение 5 мин при 55 ° С, встряхивая при 1400 оборотах в минуту.
  3. Центрифуге при 1500 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
  4. Откажитесь от колонки и хранить очищенные белки-мишени при ≤ -20 ° C.
0 "> х; "> 550 мм 2 "высота =" "стиль =" 20 высота: 20px; ширина: 597px; "> Элюирующий буфер
Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)
Na 2 HPO 4 10 мМ
KH 2 PO 4 2 мМ
NaCl 137 мм
KCl 2,7 мм
рН доводили до 7,4, если не указано иное (рН 8,0 в разделе 1.4)
Трис буферном растворе (TBS)
Трис-HCl, рН 7,4 50 мМ
нравом = стиль "20" = "высота: 20px; ширина: 299px;"> NaCl 150 мМ
Трис-солевом буфере с Tween 20 (TBST)
Трис-HCl, рН 7,4 50 мМ
NaCl 150 мМ
Tween 20 0,1% (объем / объем)
Привязка буфер
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
NaCl
NaF 5 мм
ЭДТА 0,5 мМ
Глицерин 10% (объем / объем)
ПМСФ 0,1 мм
Вымойте буфера # 1
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
NaCl 500 мм
NaF TD> 5 мм
ЭДТА 0,4 мм
Igepal CA-630 0,2% (объем / объем)
Глицерин 5% (объем / объем)
ПМСФ 0,1 мм
Вымойте буфера # 2
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
NaCl 150 мМ
Трис-HCl, рН 8,0 25 мм
SDS 1% (вес / объем)

Таблица 1. Буферы, используемые в настоящем исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процедура очистки схематически показано на фиг.1, вместе с представлением проблем, связанных с другими существующими методами очистки.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое представление процедуры очистки. Рабочий процесс включает стабилизацию смолы в сочетании Strep-Tactin тетрамера через ковалентной сшивки с BS3, связывание твин-Strep-меченого белка и приманки, связанных комплексов в сшитого полимера , смывая несвязанных белков, денатурирующих вымывание специфически связанных белковых комплексов с 1% SDS и их анализ с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Два красных шара в белке приманки обозначать-близнец Strep-тег. Ограничения другими способами очистки, показаны на вставкекоробки на право. Они включают в себя неполную вымывание белков-мишеней с биотин и загрязнения образца с Стрептококковое-Tactin следующие денатурирующих вымывание с 1% SDS.

Типичные результаты SIII-меченого очистки белка с помощью BS3-сшитый Strep-Tactin полиметакрилат смолы и денатурирующего элюирование смесью 1% SDS, показаны на рисунке 2. 10% (15 мкл) из элюата колонки, содержащей очищенный спин-меченый SIII PVA ВПГ-Pro и связанные белки анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием серебром. Отсутствие 52 кДа, соответствующей ПВА ВПГ-Pro в качестве негативного контроля полосы движения подтвердил специфичность выпадающем. 40 мкл оставшейся спин колонки элюат наносили на кератина свободной SDS геле и соответствующая полоса была вырезана и содержащиеся в нем белки расщепляли трипсином и анализировали с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Анализ масс-спектрометрии определены вирусной РНК-депеОтступ РНК-полимеразы (репликаза) СИБ как взаимодействующего партнера ВПГ-Pro. Несколько триптические пептиды, соответствующие СИБ были обнаружены во всех четырех биологических повторах аффинной очистки, и ни один в четырех управления, выражающих ВПГ-Pro без SIII-тега, подтверждающий специфику взаимодействия. Поскольку молекулярная масса СИБ (59 кДа) является близкой к SIII-меткой ВПГ-Pro (52 кДа), два белка появилась в виде двойного группой во время анализа страниц SDS (рис. 2, наконечник стрелы). Взятые вместе, результаты, описанные выше, обеспечивают экспериментальные доказательства, что аффинной очистки на Стрептококковое-Tactin смол ковалентно сшитых с БС3 может быть успешно использованы для выделения твин-Стрептококковое-меченных белков и определить свои физиологические связывающих партнеров помощью масс-спектрометрии.

Рисунок 2
SIII с метками ПВА ВПГ-Pro и его партнер по связыванию ПВА СИБ на Стрептококковое-Tactin полиметакрилатной смолы, сшитые с БС3. Из рисунка видно, серебряную окрашенных SDS-полиакриламидном геле из элюатов от сшитого бисер. Перо была определена методом масс-спектрометрии в качестве связующего партнера ВПГ-Pro использованием аликвоты и того же образца. SIII с метками ПВА ВПГ-Pro (прогноз МВт: 52 кДа) и NIB (прогноз МВт: 59 кДа) мигрируют в виде двойного диапазона, отображается в виде стрелки. Отрицательный контроль (центральный переулок) соответствует очистки от клеток, инфицированных вирусом выражая ВПГ-Pro без SIII-тега.

Рисунок 3
Рисунок 3. Биотин вымывание SIII с метками ПВА ВПГ-Pro от Стрептококковое-Tactin полиметакрилатной смолынеполным по сравнению с элюированием 1% SDS. На рисунке показан анти-ВПГ иммуноблот элюатов из бисера Стрептококковое-Tactin. Шарики элюировали либо с 15 мМ биотина или 1% SDS. Различие в интенсивности сигнала отражает различные выходы белка, полученного с помощью двух методов элюирования. Отрицательные контроли соответствуют очисток из клеток, инфицированных вирусом, выражающей ВПГ-Pro без SIII-тега.

Рисунок 4
Рисунок 4. Ковалентное сшивания с БС3 предотвращает выпуск Strep-Tactin из смолы во время SDS элюирования. Из рисунка видно, серебряную окрашенных гель SDS элюатов из не-сшитого (левой полосе) и BS3-сшитого (правая дорожка) Стрептококковое-Tactin полиметакрилата смолы. Обратите внимание на наличие выпущен Strep-Tactin в левом ряду, но его отсутствие в правом ряду.


Рисунок 5. Химическая структура бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3) и его реакции сшивки с эпсилон аминогруппами остатков лизина в Strep-Tactin.

Рисунок 6
Рисунок 6. Очистка твин-Стрептококковое-меткой зеленого флуоресцентного белка (GFP) по не сшитый, а BS3-сшитого Стрептококковое-Tactin полиметакрилатные смолы. Две равные количества человеческих эмбриональных почек 293 клеток, выражающие твин-Стрептококковое-меткой GFP лизировали и аналогичным образом обработан с вышеприведенной схемой, за исключением того, что в одном случае смола была сшитый с BS3 и в другом BS3 имеет бытьан замещенный воды в сшивающего реакции. Из рисунка видно, серебряную окрашенных SDS-полиакриламидном геле и анти-GFP иммуноблот очищенных белков. Следует отметить, что некоторое снижение урожайности белка присуща методов очистки, включающих химическое сшивание, но это компенсируется более высокой чистоты образца из-за отсутствия опубликованном Strep-Tactin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Данный протокол может быть использован для очистки любой твин-Strep-меченого приманки интерес белок и связанных комплексов в любом подходящем буфере, который не содержит биотин или сильные денатурирующих. В текущей версии протокола, связывание и стиральная выполняются в относительно жестких условиях в присутствии высокой концентрации соли и неионного моющего средства. Хотя это приводит к меньшему фоне, хрупкие белковые комплексы могут диссоциировать в этих условиях. Чтобы сохранить такие низкое сродство комплексы, концентрация соли может быть снижена и неионогенное моющее средство может быть уменьшен или исключен из связывания и мыть буферы.

Главное преимущество системы твин-Стрептококковое-тега является высокое сродство небольшой (3kDa) тандем тега инженерии стрептавидином (Стрептококковое-Tactin) 1, 2, что позволяет эффективно очистить один шаг целевых белков и их комплексов даже в партии Режим. Из-за сильной связи сдвоенными Strep-тегав Strep-Tactin, смола может быть промыт в умеренно жестких условиях, таких как высокая моющего средства и / или концентрации соли, что приводит к более высокой чистоты целевого белка. Однако такой сильной связи также имеет свои недостатки. Даже в случае белков с одной Strep-тега II (последовательность WSHPQFEK аминокислота), конкурентоспособной элюирование со смолы иногда может быть трудным. Например, элюирование из (II)-меченого протеинкиназы Strep, NtCDPK2, от полиметакрилатной смолы Strep-Tactin 10 мМ desthiobiotin оказались безуспешными, требуя денатурирующих элюирование с SDS буфере для образцов 6. Проблема была решена только после desthiobiotin был заменен более сильным конкурирующего биотина (10 мМ) и элюирование проводили в течение 5 минут с энергичного встряхивания 7. В случае двойной Strep-тега, который имеет более высокое сродство к Strep-Tactin, целевой белок элюирование может быть неполным даже при концентрациях биотина выше, чем 15 мм. Как показано на рисунке 3,только небольшая часть SIII-меченого PVA ВПГ-Pro может быть элюировали из смолы Strep-Tactin с 15 мМ биотина по сравнению с количеством, элюированной смесью 1% SDS. Важно отметить, что эффективность конкурентной элюции вероятно, также зависит от характера элюированного белка или белкового комплекса. Более крупные и гидрофобные белки могут стерически затруднить доступность биотин связывающего кармана в Strep-Tactin, тем самым делая конкурентоспособным элюирование менее эффективным. Указанные недостатки устраняются с помощью элюирования с SDS, но такие элюирования есть свои проблемы, в основном вращается вокруг того факта, что воздействие моющих средств приводит к диссоциации смолы связью Стрептококковое-Tactin тетрамеров и загрязнения образца с выпущенной Strep-Tactin 8. Это показано на рисунке 4 (левой полосе), который показывает значительное количество Strep-Tactin выпущенный после инкубации смолы Strep-Tactin в элюирующего буфера, содержащего 1% SDS. Такое загрязнение недопустимо, еслиобразец нуждается в дальнейшем проанализированы LC-MS/MS.

Эффективное решение указанной задачи загрязнения является стабилизация смолы связью Стрептококковое-Tactin тетрамере 9 ковалентными сшивки. Для этой цели мы использовали водорастворимый, нерасщепляемый, гомобифункциональное амина-реактивного кросс-компоновщика BS3 с историей успешного использования в стабилизации белковых структур 10-13. Рисунок 5 показывает химическую формулу БС3 и его сшивание Реакция со свободными группами эпсилон аминокислот лизина в Strep-Tactin. Когда смола связью Стрептококковое-Tactin тетрамером стабилизировалась путем сшивания с БС3, проблема загрязнения образца с выпущенной Strep-Tactin была практически ликвидирована (рис. 4, правый ряд). Потому что сшивание с БС3 не вызывает обширную агрегации белков 14, это не уменьшает доступность биотина связывающего кармана в стрептавидином, что делаетсшитый смола подходит для очистки Strep-меченых гибридных белков. Следует отметить, однако, что химическое сшивание белков с биологической активностью (антитела и т.д.) стабилизирует активных и неактивных белковых конформаций, что приводит к некоторой потере активности. Например, хорошо признанным методом иммунопреципитации с использованием BS3-сшитый антител дает меньший выход белка по сравнению с целевой что получены с не-сшитых антител 15. Тем не менее, некоторая потеря биологической активности считается приемлемым компромиссом для улучшения чистоты образца. Мы наблюдали подобные результаты с BS3-сшитого Стрептококковое-Tactin смолы. Несколько ниже доходности белок, полученный с сшитого полимера было более чем компенсировано значительно улучшить чистоту образца (рис. 6).

Другое потенциальное применение предлагаемого метода в очистке Стрептококковое метками мембранных белков solubilizред с моющими средствами. Моющие средства необходимы для поддержания таких гидрофобные белки и связанные с ними комплексы в растворе, но их присутствие может привести к загрязнению образца с Strep-Tactin освобожден от сродства смолы. Хорошим примером этого является очищение стрептококковая (II) с меткой мембранного белка На NTT1 на бусы Стрептококковое-Tactin с целью кристаллизации белков 8. Наличие моющего средства laurylamidodimethylpropylaminoxide (LAPAO) в буфере для элюции привело к выпуску Strep-Tactin от бисера и последующего роста нежелательных кристаллов Стрептококковое-Tactin 8. Стабилизация смолы связью Стрептококковое-Tactin тетрамере ковалентными сшивания может стать эффективным средством для преодоления этой проблемы.

Таким образом, химическое сшивание успешно использованы, чтобы преодолеть ограничения, связанные с денатурирующих элюирование со смолы Strep-Tactin. Этот подход помог добиться хорошего целевого белка повторноCovery без введения загрязнение пробы. Предлагаемый метод, таким образом, может быть использован для идентификации специфических связывающих партнеров твин-Стрептококковое-меченых приманки белков по масс-спектрометрии. Кроме того, способ может быть применен выделить и охарактеризовать нуклеопротеидных комплексов, в том числе обратимо сшитый с формальдегидом, а также мембранные белки солюбилизировали моющих средств. Наконец, химическое сшивание существенно не изменяется физические свойства смолы Strep-Tactin, в результате чего сшитый смола потенциально пригодных для высокой пропускной приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы выражаем искреннюю благодарность за техническую поддержку Сини Миеттиненом, Минна Pöllänen и Тару Раутавеси. Мы благодарим Helka Nurkkala для обеспечения НЕК 293 клетки, экспрессирующие твин-Стрептококковое-меткой GFP и Пекка Evijärvi для обеспечения звукового оборудования записи. Эта работа финансировалась Академией Финляндии, предоставить номера 138329, 134684 и 258978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics