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Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Biology

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Summary

Es wird ein Verfahren zur effizienten Reinigung von Doppel Strep-tag-Fusionsproteine ​​und deren Komplexe spezifisch auf modifizierte Streptavidin beschrieben (Strep-Tactin)-Harz kovalent mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) vernetzt. Das Verfahren hat die Vorteile der schnellen Geschwindigkeit, gute Zielprotein Recovery und hohe Reinheit und ist mit nachfolgender Analyse durch Massenspektrometrie kompatibel.

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Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

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Abstract

Affinitätsreinigung von Strep-markierten Fusionsproteinen auf Harze Durchführung eines manipulierten Streptavidin (Strep-Tactin) hat sich eine weit verbreitete Methode zur Isolierung von Proteinkomplexen unter physiologischen Bedingungen. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag bezeichnet, enthalten, haben den Vorteil der höheren Affinität für Strep-Tactin Vergleich zu denen nur eine einzige Strep-Tag enthält, so dass eine effizientere Proteinreinigung. Allerdings wird dieser Vorteil durch die Tatsache, dass die Elution von Zwillings-Strep-markierte Proteine ​​mit Biotin kann unvollständig sein, was zu einer geringen Proteinrückgewinnung auszugleichen. Die Rückgewinnung kann durch die Verwendung stark denaturierender Elution mit Natriumdodecylsulfat (SDS) verbessert werden, aber dies führt zu einer Kontamination mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt abzutasten, so dass der Test nicht mit nachgeschalteten Proteomanalyse. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein Verfahren, bei dem mit Harz gekoppelt Tetramer von Strep-Tactin entwickeltenZunächst wird durch kovalente Quervernetzung mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) und die resultierende vernetzte Harz wird dann verwendet, um Zielprotein-Komplexe in einer einzigen Charge zu reinigen Reinigungsschritt stabilisiert. Effiziente Elution mit SDS-Protein sorgt für eine gute Erholung, während der Abwesenheit von kontaminierenden Strep-Tactin ermöglicht Downstream-Protein-Analyse durch Massenspektrometrie. Als Proof of Concept, beschreiben wir hier ein Protokoll für die Reinigung von SIII-markierten viralen Protein VPg-Pro aus Kernen von Virus-infizierten N. benthamiana-Pflanzen mit dem Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit BS3 vernetzt. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-markierten Protein von Interesse reinigen und zu charakterisieren seine physiologischen Bindungspartner werden.

Introduction

In den letzten Jahren hat Strep-Tag-Technologie in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung, einschließlich der Proteomforschung und Strukturbiologie weit verbreitet. Diese Technologie zur Proteinreinigung, die auf der Fusion von rekombinanten Proteinen an einer kurzen Strep-tag-Peptid beruht, mit dem Aufkommen von Affinitätsmatrizes Durchführung Strep-Tactin, eine gentechnisch Variante von Streptavidin mit verbesserter Peptid-Bindungsfähigkeit 1, 2 gereift. Fusionsproteine, zwei Kopien von Strep-tag II, Twin-Strep-Tag oder SIII-Tag, zeigen eine höhere Affinität für Strep-Tactin Matrizen als solche, die nur eine einzige Strep-Tag, eine effizientere Reinigung der rekombinanten Proteine ​​und bezeichnet enthält ihre zugeordneten Bindungspartnern. Allerdings hat der höhere Affinität von Twin-Strep-markierte Proteine ​​zu Strep-Tactin auch seine Kehrseite. Kompetitive Elution derartiger Proteine ​​mit einem Überschuss Biotin kann unvollständig sein, was zu einer verringerten Ausbeute Zielprotein. A mErz effiziente Alternative ist die Elution mit SDS, aber es führt zu unerwünschten Kontamination der Probe mit Strep-Tactin aus dem Harz freigesetzt, so dass der Test nicht mit Proteomanalyse. Dieser Artikel stellt eine Technik, um diese Beschränkung durch die ersten Stabilisierungs harzgekuppelten Tetramer von Strep-Tactin durch chemische Vernetzung und dann unter Verwendung von SDS zur Doppel-Strep-markierte Proteine ​​und ihre zugehörigen Komplexe aus der resultierenden vernetzten Harz zu eluieren überwinden. Somit kann eine ausreichende Proteinausbeute ohne Kontamination der Probe mit Strep-Tactin erreicht werden, wodurch eine weitere Analyse durch Massenspektrometrie erlaubt.

Das Verfahren ist mit einer oberflächenexponierten SIII-Tag 3 oder Twin-Strep-Tag (Aminosäuresequenz WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK und SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK jeweils) geeignet für die Reinigung von jedem rekombinantes Fusionsprotein. Das Protein kann aus tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs sein und kann entweder aus insgesamt Zelle isoliert werdenLysat oder angereicherten Organell-Fraktion. Als Beispiel beschreiben wir hier die Reinigung eines SIII-markierten Protein VPg-Pro von Kartoffelvirus A (PVA) 4 von der Kernfraktion von PVA-infizierten Nicotiana benthamiana Pflanzen. Die Kernfraktion wurde isoliert, wie zuvor beschrieben 5, mit den folgenden Modifikationen: die Zellen wurden nicht mit Formaldehyd behandelt wurde Natriumbutyrat in alle Puffer mit 5 mM Natriumfluorid ersetzt wurde komplette Proteaseinhibitor PMSF substituiert mit Triton X-100-Konzentration im Extraktions Puffer # 2 wurde auf 0,3% gesenkt (v / v) und das Kernpellet durch Zentrifugation über Saccharose-Kissen (Extraktionspuffer # 3) erhalten wurde in 1,45 ml vorgekühltem Bindungspuffer resuspendiert und gedreht wird 1,5 Stunden bei 4 ° C. Die daraus resultierende Kernextrakt die SIII-markierten Köderprotein und die damit verbundenen Komplexe (Köder Proteinprobe) enthält, wurde gemäß dem unten beschriebenen (siehe Abschnitt 2)-Protokoll verarbeitet.

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Protocol

1. Vernetzung von Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

  1. Äquilibrieren einer abgedichteten Mikroröhrchen, das 2 mg BS3 Vernetzer auf Raumtemperatur. ACHTUNG: BS3 ist ein gefährlicher Stoff. Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen.
  2. Resuspendieren Strep-Tactin Polymethacrylatharz (50% Suspension in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl) durch kurzes kräftiges Schütteln und sofort übertragen 600 ul der Suspension auf eine Spin-Säule mit einer Pipettenspitze mit der Ende abgeschnitten.
  3. Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und mit 450 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf die Säule.
  4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 2 mehrmals, um Tris-Puffer vollständig ersetzen mit PBS und lassen Sie den Harz in 430 ul PBS auf pH 8,0 nach der letzten Zentrifugation angepasst.
  5. Punktieren Sie die Folie des Mikroröhrchens mit BS3 mit einer Pipettenspitze, die 1001, l Reinstwasser. Lösen Sie das Pulver in Wasser BS3 durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren und sofort 20 ul der Lösung für das Spin-Säule. Die Endkonzentration von BS3 in der Vernetzungsreaktion ist ~ 1,2 mm.
  6. Drehen der Säule für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie, dass das Harz richtig mit dem BS3-Lösung gemischt.
  7. Um die Reaktion abzuschrecken, addieren 6 ul 3 M Tris-HCl, pH 7,5, und dreht die Säule weitere 15 min bei Raumtemperatur.
  8. Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und Resuspendieren des vernetzten Harzes in 450 ul Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST). Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritte zwei weitere Male. Im letzten Schritt, resuspendieren Harz in 450 ul TBS.
  9. Übertragen Sie die Harzsuspension in ein frisches Röhrchen mit einer Pipettenspitze mit dem Ende abgeschnitten. Resuspendieren des Harzes in der Säule mit weiteren 450 &mgr; l TBS links und übertragen auf den gleichen Rohr. Wiederholen the letzten Schritt nochmals eine maximale Übertragung des Harzes aus der Säule, um das Rohr zu gewährleisten.
  10. Lassen Sie den Schlauch stehen für 10 Minuten bei Raumtemperatur und die Lautstärke auf 600 ul indem überschüssiges TBS. Das Harz ist bereit für den sofortigen Einsatz (empfohlen) oder können bei 4 ° C gelagert werden, ohne zu frieren.

2. Bindung des Twin-Strep-markierten Protein-Köder und assoziierten Komplexe auf die Cross-linked Strep-Tactin Polymethacrylatharz

  1. Zentrifuge 1 ml der Probe Köderprotein in Bindungspuffer bei 17.000 × g für 10 min bei 4 ° C und den Überstand in ein frisches Röhrchen.
  2. Zur Minimierung der Bindung von endogenem biotinylierten Proteine ​​an die Strep-Tactin Harz, Zugabe von Avidin zu einer Endkonzentration von 100 ug / ml und dreht 15 min bei 4 ° C.
    1. Wenn das vernetzte Harz aus Schritt 1,10 für einen längeren Zeitraum bei 4 ° C gelagert wurden, sammeln das Harz durch Zentrifugation bei 400 xg for 1 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und das Harz mit 1 ml TBST. Wiederholen der Zentrifugations-und Waschschritte noch zweimal, zuerst mit TBST und dann mit TBS gewaschen. Das Röhrchen bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C und Einstellen auf das ursprüngliche Volumen, indem überschüssiges TBS.
  3. Resuspendieren des vernetzten Strep-Tactin Harz durch Vortexen. Sofort 50 ul der Harzsuspension dem Rohr den Köder-Protein enthaltenden Probe mit einem geschnittenen Pipettenspitze und drehen noch 30 min bei 4 ° C.
  4. Während der Wartezeit eingestellt Thermomixer auf 55 ° C vorheizen und 500 ul Elutionspuffer zur Verwendung in Schritt 3.1.
  5. Zentrifuge bei 400 × g für 1 min bei 4 ° C. Verwerfen des Überstandes und Waschen des Harzes auf einem Rotator für 5 min bei 4 ° C mit 1 ml vorgekühltes Waschpuffer # 1. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritte dreimal. Im letzten Schritt, resuspendieren Harz in 250 ul Waschpuffer # 2.
  6. Tr ansfer die Harzsuspension in einen frischen Spin-Säule. Resuspendieren des restlichen in dem Rohr in einem anderen 250 ul Waschpuffer # 2 Harz und übertragen auf den gleichen Spalte.
  7. Zentrifuge bei 400 g für 3 min bei 4 ° C, entsorgen Sie die Durchfluss und übertragen Sie die Spalte zu einem frischen Delphin-Nase-2-ml-Tube. Gehen Sie sofort auf die Elution Schritt unten.

3. Spezifische Elution der Proteinkomplexe

  1. Jeweils 150 ul der vorgewärmten Elutionspuffer von Schritt 2.4, um die Spin-Säule.
  2. Inkubation in Thermomixer für 5 min bei 55 ° C, bei 1.400 Umdrehungen pro Minute zittern.
  3. Zentrifugieren bei 1500 × g für 1 min bei Raumtemperatur.
  4. Entsorgen Sie die Spalte und speichern die gereinigten Zielproteine ​​bei ≤ -20 ° C
0 "> x; "> 550 mM 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; width: 597px; "> Elutionspuffer
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 2 mM
NaCl 137 mM
KCl 2,7 mM
pH-Wert auf 7,4 eingestellt, sofern nicht anders angegeben (pH 8.0 in Abschnitt 1.4)
Tris-gepufferter Salzlösung (TBS)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
ght = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl 150 mM
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0,1% (v / v)
Bindungspuffer
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0,5 mM
Glycerol 10% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Waschpuffer # 1
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0,4 mM
Igepal CA-630 0,2% (v / v)
Glycerol 5% (v / v)
PMSF 0,1 mM
Waschpuffer # 2
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
SDS 1% (w / v)

Tabelle 1. Puffer in der vorliegenden Studie verwendet.

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Representative Results

Das Reinigungsverfahren ist schematisch in Fig. 1 dargestellt, zusammen mit einer Darstellung von Problemen mit bestehenden Reinigungsverfahren verbunden sind.

Figur 1
1. Schematische Darstellung des Reinigungsverfahrens. Der Workflow umfasst die Stabilisierung des harzgekuppelten Strep-Tactin Tetramer über kovalente Quervernetzung mit BS3, die Bindung des Doppel Strep-markierten Köderprotein und assoziierte Komplexe vernetzten Harz , Waschen entfernt von ungebundenen Proteine, denaturierenden Elution der spezifisch gebundenen Proteinkomplexe mit 1% SDS und deren Analyse durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Zwei rote Kugeln in der Köderprotein bezeichnen die Twin-Strep-Tag. Einschränkungen von anderen Reinigungsverfahren sind in Leiste dargestelltKästen auf der rechten Seite. Sie umfassen unvollständige Elution von Zielproteinen mit Biotin und Kontamination der Probe mit Strep-Tactin folgenden denaturierende Elution mit 1% SDS.

Typische Ergebnisse des SIII-markierten Proteinreinigung unter Verwendung der BS3 netzten Strep-Tactin Polymethacrylatharz und denaturierenden Elution mit 1% SDS in 2 gezeigt. 10% (15 ul) der Spinsäule enthaltende Eluat gereinigt SIII-markierten PVA VPg-Pro und assoziierte Proteine ​​wurde durch SDS-PAGE, gefolgt von Silberfärbung analysiert. Das Fehlen der 52 kDa Bande, die PVA VPg-Pro in der negativen Kontrollbahn bestätigt die Spezifität des Pull-down. 40 &mgr; l der verbleibenden Spinsäule Eluat wurden auf ein Keratin-freien SDS-Gel aufgetragen und das entsprechende Fahrspur herausgeschnitten und die darin enthaltenen Proteine ​​wurden mit Trypsin digeriert und durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Die Massenspektrometrie-Analyse identifiziert viralen RNA-dependent RNA-Polymerase (Replikase) NIb als Interaktionspartner von VPg-Pro. Mehrere tryptischen Peptide, die NIb wurden in allen vier biologischen Replikaten des Affinitätsreinigung und keiner in den vier Kontrollen VPg-Pro auszudrücken, ohne die SIII-Tag, bestätigt die Spezifität der Wechselwirkung festgestellt. Da das Molekulargewicht der Spitze (59 kDa) ist nahe an der SIII-markierten VPg-Pro (52 kDa), erschienen die beiden Proteine ​​als Doppelbande bei der SDS-PAGE-Analyse (Fig. 2, Pfeil). Zusammengenommen zeigen die oben beschriebenen Ergebnisse liefern den experimentellen Beweis, daß die Affinitätsreinigung von Strep-Tactin Harze mit BS3 kovalent vernetzte kann erfolgreich eingesetzt werden, um Doppel Strep-markierte Proteine ​​zu isolieren und zu identifizieren, ihre physiologischen Bindungspartner durch Massenspektrometrie werden.

Figur 2
SIII-markierten PVA VPg-Pro und dessen Bindungspartner PVA NIb auf Strep-Tactin Polymethacrylatharz mit BS3 vernetzt. Die Abbildung zeigt eine Silber-gefärbten SDS-Polyacrylamid-Gel von Eluaten aus dem vernetzten Perlen. NIb wurde durch Massenspektrometrie als Bindungspartner von VPg-Pro in einem aliquoten der gleichen Probe identifiziert. SIII-markierten PVA VPg-Pro (voraus MW: 52 kDa) und NIb (voraus MW: 59 kDa) wandern als Doppelband, durch eine Pfeilspitze angezeigt. Negative Kontrolle (Mittelstreifen) entspricht, um die Reinigung von Zellen mit dem Virus, VPg-Pro ohne die SIII-Tag infiziert.

Fig. 3
Abbildung 3. Elution von Biotin-markierten SIII PVA VPg-Pro von Strep-Tactin Polymethacrylatharz wirdunvollständig im Vergleich zu der Elution mit 1% SDS. Die Abbildung zeigt eine Anti-VPg Immunoblot von Eluaten aus Strep-Tactin Perlen. Die Kügelchen wurden entweder mit 15 mM Biotin oder mit 1% SDS eluiert. Der Unterschied in der Signalintensität spiegelt verschiedene Proteinausbeuten mit den beiden Elution Techniken erhalten. Negative Kontrollen entsprechen Reinigungen aus Zellen mit dem Virus VPg-Pro auszudrücken, ohne die SIII-Tag infiziert.

Fig. 4
Abbildung 4. Kovalente Vernetzung mit BS3 verhindert die Freisetzung von Strep-Tactin aus dem Harz während der SDS-Elution. Die Abbildung zeigt ein silbergefärbten SDS-Gel von Eluaten aus nicht-vernetzte (linke Spur) und BS3-vernetzt (rechte Spur) Strep-Tactin Polymethacrylatharz. Beachten Sie die Anwesenheit von frei Strep-Tactin auf der linken Spur, aber seine Abwesenheit in der rechten Spur.


5. Chemische Struktur von Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) und dessen Vernetzungsreaktion mit epsilon-Aminogruppen von Lysinresten in Strep-Tactin.

Fig. 6
6. Reinigung von Doppel Strep-markierten grün fluoreszierendes Protein (GFP) an nicht-vernetztem und BS3 netzten Strep-Tactin Polymethacrylatharz. Zwei gleiche Mengen an menschlichen embryonalen Nierenzellen 293 Twin-Strep-markierten GFP wurden lysiert und unter Verwendung des obigen Protokolls, außer daß in einem Fall das Harz wurde mit BS3 vernetzt und in der anderen BS3 wurde in ähnlicher Weise verarbeitet werdenen mit Wasser ersetzt in der Vernetzungsreaktion. Die Figur zeigt eine silbergefärbte SDS-Polyacrylamid-Gel-und Anti-GFP-Immunoblot von gereinigten Proteinen. Beachten Sie, dass einige Abnahme der Proteinausbeute ist inhärent Reinigungsverfahren mit chemischen Vernetzung, aber dies wird durch die höhere Reinheit der Probe aufgrund der Abwesenheit von frei Strep-Tactin kompensiert.

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Discussion

Das obige Protokoll kann verwendet werden, um jede Doppel Strep-getaggte Köder Protein von Interesse und die damit verbundenen Komplexe in jeder geeigneten Puffer, die nicht Biotin oder starke Vergällungsmittel enthält reinigen. In der aktuellen Version des Protokolls, Bindung und Waschen unter relativ stringenten Bedingungen in der Gegenwart von hohen Salz und nicht-ionischen Detergens durchgeführt. Dies führt zwar zu weniger Hintergrund, kann fragilen Proteinkomplexe unter diesen Bedingungen zu distanzieren. Um solche geringere Affinität Komplexe zu erhalten, dürfen Salzkonzentration gesenkt werden und nicht-ionischen Detergens kann reduziert oder weggelassen werden, aus der Bindung und Waschpuffer.

Der Hauptvorteil des Doppel Strep-Tag-System ist die hohe Affinität der kleinen (3kDa) Tandem-Tag entwickelt, Streptavidin (Strep-Tactin) 1, 2, die eine effiziente Ein-Schritt-Reinigung der Ziel-Proteine ​​und ihre Komplexe auch im Batch- Modus. Wegen der starken Bindung von Twin-Strep-TagStrep-Tactin kann das Harz unter mäßig stringenten Bedingungen, wie hohe Wasch-und / oder Salzkonzentrationen, die höher Zielproteinreinheit führt gewaschen werden. Allerdings hat auch, wie starke Bindung seine Nachteile. Selbst in dem Fall von Proteinen mit einem einzelnen Strep-Tag II (Aminosäure-Sequenz WSHPQFEK) kann kompetitive Elution aus dem Harz manchmal schwierig sein. Beispielsweise Elution eines Strep (II)-markierten Proteinkinase, NtCDPK2 von der Strep-Tactin Polymethacrylat-Harz mit 10 mM Desthiobiotin als nicht erfolgreich erwiesen, erfordern denaturierenden Elution mit SDS-Probenpuffer 6. Das Problem wurde behoben erst nach Desthiobiotin wurde mit stärkeren Wettbewerb Biotin (10 mM) und Elution wurde für 5 Minuten unter starkem Schütteln 7 durchgeführt ersetzt. Im Fall des Doppel Strep-Tag, das einer höheren Affinität für Strep-Tactin hat, kann Zielprotein Elution unvollständigen auch bei Biotin-Konzentrationen so hoch wie 15 mm sein. Wie in Fig. 3 gezeigt ist,Nur ein kleiner Bruchteil SIII-markierten PVA VPg-Pro können von dem Strep-Tactin Harz mit 15 mM Biotin eluiert, verglichen mit der Menge bei 1% SDS eluiert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Effizienz der kompetitive Elution wahrscheinlich auch abhängig von der Art des eluierten Proteins oder Proteinkomplexes. Größere und hydrophobe Proteine ​​können sterisch behindern die Zugänglichkeit des Biotin-Bindungstasche in Strep-Tactin, wodurch kompetitive Elution weniger effizient. Die obigen Nachteile werden durch die Verwendung einer Elution mit SDS vermieden, aber eine solche Elution hat seine eigenen Probleme, insbesondere rund um die Tatsache, dass die Exposition gegenüber Reinigungsmitteln führt zur Dissoziation der harzgekuppelten Strep-Tactin Tetramere und Kontamination der Probe mit frei Strep-Tactin 8. Dies ist in Fig. 4 (linke Spur), gezeigt, welche eine beträchtliche Menge von Strep-Tactin nach Inkubation des Strep-Tactin Harz in Elutionspuffer, enthaltend 1% SDS freigesetzt zeigt. Diese Verunreinigung ist nicht akzeptabel, wenndie Probe muss weiter mittels LC-MS/MS analysiert werden.

Eine effektive Lösung für das obige Problem ist die Verunreinigung Stabilisierung der harzgekuppelten Strep-Tactin Tetramer 9 durch kovalente Vernetzung. Zu diesem Zweck verwendet man ein wasserlösliches, nicht-spaltbaren, homobifunktionelle Amin-reaktive Vernetzer BS3 mit einer Geschichte der erfolgreichen Einsatz bei der Stabilisierung von Proteinstrukturen 10-13. Fig. 5 zeigt die chemische Formel der BS3 und ihre Vernetzung Reaktion mit freien epsilon-Aminogruppen von Lysin in Strep-Tactin. Wenn das Harz gekoppelt Strep-Tactin Tetramer wurde durch Vernetzen mit BS3 stabilisiert hatte, wurde das Problem der Kontamination der Probe mit frei Strep-Tactin praktisch beseitigt (Fig. 4, rechte Spur). Da das Vernetzen mit BS3 hat umfangreiche Proteinaggregation 14 verursachen, ist es nicht die Zugänglichkeit des Biotin-Streptavidin-Bindungstasche in verringern, wodurch dieVernetztes Harz geeignet zur Reinigung von Strep-markierten Fusionsproteinen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die chemische Vernetzung von Proteinen mit biologischer Aktivität (Antikörper usw.) stabilisiert sowohl aktive als auch inaktive Protein-Konformationen, die zu einem gewissen Aktivitätsverlust. Beispielsweise die gut etablierten Verfahren unter Verwendung von Immunpräzipitation BS3 vernetzten Antikörper eine niedrigere Zielproteinausbeute im Vergleich zu nicht-vernetzten Antikörper 15 erhalten. Trotzdem wird ein gewisser Verlust an biologischer Aktivität als akzeptabler Kompromiß für die verbesserte Reinheit der Probe sein. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit der BS3 netzten Strep-Tactin Harz beobachtet. Die etwas geringeren Proteingehalt mit dem vernetzten Harz erhalten wurde jedoch durch die stark verbesserte Reinheit der Probe (6) kompensiert.

Eine weitere potentielle Anwendung des vorgeschlagenen Verfahrens ist die Reinigung von Strep-tag Membranproteine ​​solubilizmit Wasch-ed. Reinigungsmittel sind für die Aufbewahrung solcher hydrophobe Proteine ​​und die damit verbundenen Komplexe in Lösung, aber ihre Anwesenheit auf Probe eine Kontamination mit Strep-Tactin von der Affinitätsharz freigegeben führen. Ein gutes Beispiel hierfür ist die Reinigung eines Strep-(II)-markierten Membranproteins in die NTT1 auf Strep-Tactin Perlen zum Zweck der Proteinkristallisation 8. Die Anwesenheit des Detergens laurylamidodimethylpropylaminoxide (Lapao) im Elutionspuffer führte zur Freisetzung von Strep-Tactin von den Kügelchen und das anschließende Wachstum von unerwünschten Strep-Tactin Kristalle 8. Stabilisierung der harzgekuppelten Strep-Tactin Tetramer durch kovalente Vernetzung kann ein wirksames Mittel, um dieses Problem zu überwinden.

Zusammenfassend wurde eine chemische Vernetzung erfolgreich eingesetzt worden, um die Beschränkungen mit denaturierenden Elution aus dem Strep-Tactin Harzes zu überwinden. Dieser Ansatz half gute Zielprotein wieder zu erreichenErholung ohne Einführung von Probenkontamination. Das vorgeschlagene Verfahren kann somit verwendet werden, um spezifische Bindungspartner des zwei Strep-markierten Köder-Proteine ​​durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Ferner kann das Verfahren angewendet werden, zu isolieren und zu charakterisieren Nucleoprotein-Komplexe, einschließlich die mit Formaldehyd reversibler Vernetzung sowie Membranproteine ​​mit Detergentien solubilisiert. Schließlich chemische Vernetzung nicht wesentlich die physikalischen Eigenschaften des Strep-Tactin Harz zu ändern, so dass das vernetzte Harz potenziell geeignet für Anwendungen mit hohem Durchsatz.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir danken für die technische Unterstützung von Sini Miettinen, Minna Pöllänen und Taru Rautavesi. Wir bedanken uns für die Bereitstellung Helka Nurkkala HEK 293-Zellen, die Twin-Strep-getaggte GFP und Pekka Evijärvi für die Bereitstellung von Aufnahmegerät. Diese Arbeit wurde von der Akademie von Finnland finanziert, gewähren Nummern 138329, 134684 und 258978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

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References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

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