Author Produced

Ett steg Rening av Twin-Strep-märkta proteiner och deras komplex på Strep-Tactin Resin tvärbunden med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ett förfarande beskrivs för effektiv rening av twin-Strep-märkta fusionsproteiner och deras specifika komplex på modifierad streptavidin (Strep-Tactin)-harts som är kovalent tvärbundet med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3). Metoden har fördelarna av snabb hastighet, bra mål proteinutvinning och hög renhet, och är kompatibel med efterföljande analys genom masspektrometri.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ivanov, K. I., Bašić, M., Varjosalo, M., Mäkinen, K. One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3). J. Vis. Exp. (86), e51536, doi:10.3791/51536 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Affinitetsrening av Strep-taggade fusionsproteiner på hartser som bär en konstruerad streptavidin (Strep-Tactin) har blivit en allmänt använd metod för isolering av protein-komplex under fysiologiska betingelser. Fusionsproteiner som innehåller två kopior av Strep-Tag II, betecknade twin-Strep-tagg eller SIII-taggen, har fördelen av högre affinitet för Strep-Tactin jämfört med de som innehåller endast en enda Strep-Tag, vilket möjliggör mer effektiv proteinrening. Dock är denna fördel kompenseras av att eluering av twin-Strep-märkta proteiner med biotin kan vara ofullständig, vilket leder till låg protein återhämtning. Utvinningen kan förbättras dramatiskt genom användning av denaturerande eluering med natriumdodecylsulfat (SDS), men detta leder till prov kontaminering med Strep-Tactin frigöras från hartset, vilket gör analysen oförenligt med nedströms proteomic analys. För att övervinna denna begränsning, har vi utvecklat en metod där harts kopplade tetramer av Strep-Tactinförst stabiliseras genom kovalent tvärbindning med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3), och den resulterande tvärbundna harts används sedan för att rena mål-protein-komplex i en enda sats reningssteg. Effektiv eluering med SDS säkerställer god proteinutvinning, och avsaknaden av kontaminerande Strep-Tactin tillåter nedströms proteinanalys med masspektrometri. Som ett bevis på koncept, beskriver vi här ett protokoll för rening av SIII-märkta virusprotein Vpg-Pro från kärnor av virusinfekterade N. benthamiana växter genom användning av Strep-Tactin polymetakrylatharts tvärbunden med BS3. Samma protokoll kan användas för att rena varje twin-Strep-inmärkt protein av intresse och karakterisera dess fysiologiska bindningspartners.

Introduction

Under de senaste åren har Strep-tagg tekniken blivit allmänt använda inom många områden av biomedicinsk forskning, inklusive proteomik och strukturbiologi. Denna proteinreningsteknik, som förlitar sig på fusion av rekombinanta proteiner med en kort Strep-Tag-peptiden, har mognat med tillkomsten av affinitetsmatriser transporterar Strep-Tactin, en genetiskt modifierad variant av streptavidin med förbättrad peptidbindande kapacitet. 1, 2 Fusionsproteiner som innehåller två kopior av Strep-Tag II, betecknade twin-Strep-tagg eller SIII-etikett, uppvisar en högre affinitet för Strep-Tactin matriser än de som innehåller endast en enda Strep-Tag, vilket säkerställer mer effektiv rening av de rekombinanta proteinerna och deras tillhörande bindningspartners. Emellertid har högre affinitet av twin-Strep-märkta proteiner till Strep-Tactin också sin baksida. Konkurrens eluering av sådana proteiner med överskott biotin kan vara ofullständig, vilket leder till minskad målprotein avkastning. A mmalmen effektivt alternativ är eluering med SDS, men det leder till oönskad förorening provet med Strep-Tactin frigöras från hartset, vilket gör analysen oförenligt med proteomic analys. Detta dokument presenterar en teknik för att övervinna denna begränsning genom att först stabilisera hartskopplade tetramer av Strep-Tactin genom kemisk tvärbindning och därefter med användning av SDS för att eluera twin-Strep-märkta proteiner och deras associerade komplex från den resulterande tvärbundna hartset. Således kan tillräcklig proteinutbytet uppnås utan provkontaminering med Strep-Tactin därigenom medge ytterligare analys med masspektrometri.

Metoden lämpar sig för rening av vilken rekombinant fusionsprotein med en ytexponerade SIII tagg 3 eller tvilling-Strep-Tag (aminosyrasekvens WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK och SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respektive). Proteinet kan vara av djur-, växt-eller bakterieursprung och kan isoleras från antingen totalt celllysat eller berikad organell fraktionen. Som ett exempel beskriver vi här rening av en SIII-märkt protein Vpg-Pro av potatisvirus A (PVA) 4 från den nukleära fraktionen av PVA-infekterade Nicotiana benthamiana växter. Den nukleära fraktionen isolerades som tidigare beskrivits 5, med följande modifieringar: celler som inte behandlats med formaldehyd, har natriumbutyrat substituerade i alla buffertar med 5 mM natriumfluorid, var fullständig proteasinhibitor substituerad med PMSF, Triton X-100-koncentrationen i extraktion buffert # 2 var sänkt till 0,3% (v / v) och den nukleära pelleten erhållen genom centrifugering genom sackaros dyna (extraktionsbuffert # 3) återsuspenderades i 1,45 ml av i förväg kyld bindande buffert och roterades under 1,5 timmar vid 4 ° C. Det resulterande kärnextrakt som innehåller SIII-taggade bete protein och tillhörande komplex (bete protein prov) behandlades enligt protokollet som beskrivs nedan (se avsnitt 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tvärbindning av Strep-Tactin polymetakrylatharts med bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)

  1. Jämvikta en förseglad mikrorör innehållande 2 mg BS3 tvärbindare till rumstemperatur. VARNING: BS3 är ett farligt ämne. Använd skyddshandskar och skyddsglasögon.
  2. Resuspendera Strep-Tactin polymetakrylatharts (50% suspension i 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) genom kortvarig kraftig skakning och omedelbart överför 600 pl av suspensionen till en centrifugeringskolonn med användning av en pipettspets med end avskuren.
  3. Centrifugera vid 1500 x g under 30 sek vid rumstemperatur. Kassera genomströmning och tillsätt 450 l av fosfat saltlösning (PBS) i kolonnen.
  4. Upprepa föregående steg 2 gånger för att helt ersätta Tris-buffert med PBS och lämna harts i 430 l PBS justerat till pH 8,0 efter den sista centrifugeringen.
  5. Punktera folien av mikrorör med BS3 med en pipett spets innehållande 1001; ll ultrarent vatten. Upplös BS3 pulver i vatten genom att försiktigt pipettera upp och ned och omedelbart lägga 20 ul av lösningen på den spinnkolonn. Den slutliga koncentrationen av BS3 i tvärbindningsreaktionen är ~ 1,2 mM.
  6. Rotera kolonnen under 30 min vid rumstemperatur. Kontrollera att plasten blandas ordentligt med BS3 lösningen.
  7. För att stoppa reaktionen, tillsätt 6 ul av 3M Tris-HCl, pH 7,5 och rotera kolonnen under ytterligare 15 minuter vid rumstemperatur.
  8. Centrifugera vid 1500 x g under 30 sek vid rumstemperatur. Kassera genomströmning och resuspendera den tvärbundna hartset i 450 | il Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST). Upprepa centrifugeringen och tvätta steg två gånger till. Vid det sista steget, återsuspendera hartsen i 450 | il TBS.
  9. Överför massan suspensionen till ett nytt rör med användning av en pipettspets med änden avskurna. Resuspendera hartset kvar i kolumnen med ytterligare 450 l av TBS och överföra till samma rör. Upprepa the sista steget en gång till för att säkerställa maximal överföring av kåda från kolumnen till röret.
  10. Låt röret stå i 10 minuter vid rumstemperatur och justera volymen till 600 pl genom att avlägsna överskott av TBS. Hartset är redo för omedelbar användning (rekommenderas) eller kan lagras vid 4 ° C utan att frysa.

2. Bindning av Twin-Strep-märkta Bait Protein och Associated komplex till Tvärbunden Strep-Tactin polymetakrylatharts

  1. Centrifugera 1 ml prov betet protein i bindande buffert vid 17000 x g under 10 min vid 4 ° C och överför supernatanten till ett nytt rör.
  2. För att minimera bindning av endogena biotinylerade proteiner till Strep-Tactin hartset, tillsättning av avidin till en slutlig koncentration av 100 | ig / ml och rotera under 15 minuter vid 4 ° C.
    1. Om den tvärbundna hartset från steg 1,10 har lagrats under en längre tid vid 4 ° C, samla hartset genom centrifugering vid 400 x g for 1 min vid 4 ° C, kassera supernatanten och tvätta hartset med 1 ml TBST. Upprepa centrifugering och tvättsteg två gånger, först med TBST och sedan med TBS. Centrifugera röret vid 400 xg under 1 min vid 4 ° C och anpassa sig till den ursprungliga volymen genom att avlägsna överskott av TBS.
  3. Resuspendera tvärbunden Strep-Tactin harts med vortex. Tillsätt omedelbart 50 ul av hartssuspension till röret innehållande provet betet protein med användning av ett snitt pipettspetsen och rotera under ytterligare 30 minuter vid 4 ° C.
  4. Medan du väntar, ställa Thermo till 55 ° C och förvärma 500 l av eluering buffert för användning i steg 3.1.
  5. Centrifugera vid 400 x g under 1 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tvätta hartset på en rotator under 5 min vid 4 ° C med 1 ml av en pre-kyld tvättbuffert # 1. Upprepa centrifugeringen och tvätta steg tre gånger. Vid det sista steget, återsuspendera hartsen i 250 pl av tvättbuffert # 2.
  6. Tr ansfer hartssuspension till ett färskt spinnkolonn. Resuspendera harts kvar i röret i ytterligare 250 pl av tvättbuffert # 2 och överför till samma kolumn.
  7. Centrifugera vid 400 xg under 3 min vid 4 ° C, kasta genomströmning och överföra kolumnen till en ny delfin-näsa 2 ml tub. Gå direkt till elueringssteget nedan.

3. Eluering av specifik proteinkomplex

  1. Addera 150 pl av förvärmd elueringsbuffert från steg 2,4 till spinnkolonn.
  2. Inkubera i Thermo 5 minuter vid 55 ° C, skakning vid 1400 rpm.
  3. Centrifugera vid 1500 x g under 1 min vid rumstemperatur.
  4. Kasta kolumnen och lagra de renade målproteiner vid ≤ -20 ° C.
0 "> x, "> 550 mM 2 "height =" 20 "style =" height: 20px; width: 597px; "> Elueringsbuffert
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 2 mM
NaCl 137 mM
KCl 2,7 mM
pH justerades till 7,4 om inte annat anges (pH 8,0 i avsnitt 1.4)
Tris-buffrad saltlösning (TBS)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
GHT = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl 150 mM
Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST)
Tris-HCl, pH 7,4 50 mM
NaCl 150 mM
Tween 20 0,1% (vol / vol)
Bindningsbuffert
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl
NaF 5 mM
EDTA 0,5 mM
Glycerol 10% (vol / vol)
PMSF 0,1 mM
Tvättbuffert # 1
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 500 mM
NaF td> 5 mM
EDTA 0,4 mM
Igepal CA-630 0,2% (vol / vol)
Glycerol 5% (volym / volym)
PMSF 0,1 mM
Tvätta buffert # 2
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
NaCl 150 mM
Tris-HCl, pH 8,0 25 mM
SDS 1% (vikt / volym)

Tabell 1. Buffertar som används i föreliggande studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reningsproceduren illustreras schematiskt i figur 1, tillsammans med en representation av problem som är förknippade med andra existerande reningsmetoder.

Figur 1
Figur 1. Schematisk representation av reningsförfarandet. Arbetsflödet innefattar stabilisering av hartskopplade Strep-Tactin tetramer genom kovalent tvärbindning med BS3, bindning av twin-Strep-inmärkt betesprotein och tillhörande komplex att det tvärbundna hartset , borttvättning av obundna proteiner, denaturerande eluering av de specifikt bundna proteinkomplex med 1% SDS och deras analys genom vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS/MS). Två röda sfärer i betesprotein beteckna twin-Strep-tagg. Begränsningar med andra reningsmetoder visas i infälldarutorna till höger. De omfattar ofullständig eluering av målproteiner med biotin och provkontaminering med Strep-Tactin efter denaturering eluering med 1% SDS.

Typiska resultat av den SIII-märkta proteinrening med användning av BS3-tvärbundet Strep-Tactin polymetakrylatharts och denaturerande eluering med 1% SDS visas i Figur 2. 10% (15 ul) av spinnkolonn-eluatet innehållande renat SIII-märkta PVA Vpg-Pro och associerade proteiner analyserades genom SDS-PAGE följt av silverfärgning. Frånvaron av kDa bandet 52 motsvarande PVA Vpg-Pro i den negativa kontrollen körfält bekräftade specificiteten rullgardins. 40 | il av den återstående spinnkolonn eluatet applicerades på en keratin fritt SDS-gel och den motsvarande lane skars ut och de inneslutna proteinerna digererades med trypsin och analyserades genom vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS/MS). Den masspektrometri analys identifierade virus-RNA-Dependent RNA-polymeras (replikas) NIB som samverkande partner Vpg-Pro. Flertal tryptiska peptider motsvarande NIB detekterades i alla fyra biologiska replikat av affinitetsrening och ingen i de fyra kontroller som uttrycker Vpg-Pro utan SIII-taggen, vilket bekräftar specificiteten hos interaktionen. Eftersom molekylvikten för nib (59 kDa) är nära den i SIII-tagged Vpg-Pro (52 kDa), verkade de två proteinerna som ett dubbelband vid SDS-PAGE-analys (Figur 2, pilspets). Sammantaget visar de resultat som beskrivs ovan tillhandahåller experimentella bevis för att affinitetsrening på Strep-Tactin hartser kovalent tvärbundna med BS3 kan med framgång användas för att isolera twin-Strep-märkta proteiner och identifiera deras fysiologiska bindningspartners med masspektrometri.

Figur 2
SIII-tagged PVA Vpg-Pro och dess bindningspartner PVA nib på Strep-Tactin polymetakrylatharts tvärbunden med BS3. Figuren visar en silverfärgad SDS-polyakrylamidgel av eluaten från den tvärbundna pärlor. NIB identifierades med masspektrometri som en bindningspartner av Vpg-Pro med användning av en alikvot av samma prov. SIII-taggade PVA Vpg-Pro (förutspådde MW: 52 kDa) och NIB (förutspådde MW: 59 kDa) vandrar som en dubbel band, indikeras av en pilspets. Negativ kontroll (central körfält) motsvarar rening från celler infekterade med viruset som uttrycker Vpg-Pro utan SIII-taggen.

Figur 3
Figur 3. Biotin eluering av SIII-märkta PVA Vpg-Pro från Strep-Tactin polymetakrylatharts ärofullständigt jämfört med eluering med 1% SDS. Figuren visar en anti-Vpg immunoblot av eluaten från Strep-Tactin pärlor. Pärlorna eluerades antingen med 15 mM biotin eller med 1% SDS. Skillnaden i signalintensitet speglar olika protein avkastning som erhålls med de två elueringstekniker. Negativa kontroller motsvarar reningar från celler infekterade med viruset som uttrycker Vpg-Pro utan SIII-taggen.

Figur 4
Figur 4. Kovalent tvärbindning med BS3 förhindrar utsläpp av Strep-Tactin från hartset under SDS eluering. Figuren visar en silverfärgad gel av SDS-eluaten från icke-tvärbunden (vänster körfält) och BS3-tvärbundet (höger körfält) Strep-Tactin polymetakrylatharts. Notera förekomsten av släppt Strep-Tactin i vänsterfilen, men dess frånvaro i rätt körfält.


Figur 5. Kemisk struktur av bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3), och dess tvärbindningsreaktion med epsilon-aminogrupper i lysinrester i Strep-Tactin.

Figur 6
Figur 6. Rening av twin-Strep-inmärkt grönt fluorescerande protein (GFP) på icke-tvärbundna och BS3-tvärbundet Strep-Tactin polymetakrylatharts. Två lika stora mängder av humana embryonala njur 293-celler som uttrycker twin-Strep-inmärkt GFP lyserades och på liknande sätt bearbetas med ovanstående protokoll, med undantag för att i ett fall hartset har tvärbundits med BS3 och i den andra BS3 har varaen substituerad med vatten i tvärbindningsreaktionen. Figuren visar en silverfärgad SDS-polyakrylamidgel och anti-GFP-immunoblot av renade proteiner. Observera att vissa minskning av proteinavkastningen är inneboende i reningsmetoder som involverar kemisk tvärbindning, men detta kompenseras av högre prov renhet på grund av frånvaron av frisatt Strep-Tactin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det ovanstående protokollet kan användas för att rena varje twin-Strep-taggat bete proteinet av intresse och dess associerade komplex i vilken lämplig buffert som inte innehåller biotin eller starka denatureringsmedel. I den nuvarande versionen av protokollet, bindande och tvätt utförs under relativt stränga förhållanden i närvaro av höga salt-och icke-jonisk detergent. Även om detta resulterar i mindre bakgrund, kan de instabila proteinkomplex dissociera under dessa betingelser. För att bevara dessa lägre affinitet komplex, kan saltkoncentrationen sänkas och nonjoniska tvättmedel kan minskas eller uteslutas från att binda och tvätta buffertar.

Den huvudsakliga fördelen med den dubbla Strep-Tag-system är den höga affiniteten av den lilla (3kDa) tandem tagg till engineered streptavidin (Strep-Tactin) 1, 2, vilket möjliggör en effektiv en-stegs rening av målproteinerna och deras komplex även i batch läge. På grund av den starka bindningen av twin-Strep-Tagtill Strep-Tactin kan hartset tvättas under måttligt stränga förhållanden, såsom hög rengöringsmedel och / eller saltkoncentrationer, vilket resulterar i högre målprotein renhet. Men en sådan stark bindning har också sina nackdelar. Även i fallet med proteiner med en enda Strep-Tag II (aminosyrasekvens WSHPQFEK) kan konkurrenskraftig eluering från hartset ibland vara svår. Exempelvis eluering av en Strep (II)-märkta proteinkinas, NtCDPK2, från Strep-Tactin polymetakrylatharts med 10 mM destiobiotin visat sig vara misslyckat, som kräver denature eluering med SDS-provbuffert 6. Problemet löstes först efter destiobiotin ersattes med starkare konkurrerande biotin (10 mM) och eluering utfördes under 5 minuter med kraftig skakning 7. I fallet med den dubbla Strep-tagg, som har högre affinitet för Strep-Tactin kan målproteinet eluering vara ofullständig även vid biotin-koncentrationer så höga som 15 mM. Såsom visas i figur 3,endast en liten fraktion av SIII-tagged PVA Vpg-Pro kunde elueras från Strep-Tactin hartset med 15 mM biotin jämfört med den mängd som eluerades med 1% SDS. Det är viktigt att notera att effektiviteten i konkurrens eluering sannolikt beror också på naturen av den eluerade protein eller proteinkomplex. Större och mer hydrofoba proteinerna kan steriskt hindra tillgången till den biotin-bindande fickan i Strep-Tactin därigenom göra konkurrenskraftig eluering mindre effektiv. De ovan nämnda nackdelarna undvikes genom användning av eluering med SDS, men en sådan eluering har sina egna problem, i huvudsak kretsar kring det faktum att exponering för tvättmedel leder till dissociation av hartskopplade Strep-Tactin tetramerer och provkontaminering med utsläppt Strep-Tactin 8. Detta visas i figur 4 (vänster körfält), vilket visar en avsevärd mängd av Strep-Tactin frisatt efter inkubation av Strep-Tactin harts i elueringsbuffert innehållande 1% SDS. Sådan kontaminering är oacceptabelt omprovet behöver analyseras ytterligare med LC-MS/MS.

En effektiv lösning på ovanstående problem med kontamination är stabiliseringen av hartskopplade Strep-Tactin tetramer 9 genom kovalent tvärbindning. För detta ändamål använde vi ett vattenlösligt, icke-klyvbart, homobifunktionella aminreaktiva tvärbindnings BS3 med en historia av framgångsrik användning stabilisera proteinstrukturer 10-13. Figur 5 visar den kemiska formeln för BS3 och dess tvärbindning reaktion med fria epsilon aminogrupper av lysin i Strep-Tactin. När hartskopplade Strep-Tactin tetramer stabiliserades genom tvärbindning med BS3, var problemet med kontamination med släppt Strep-Tactin praktiskt taget elimineras (Figur 4, höger körfält). Eftersom tvärbindningen med BS3 inte orsakar omfattande proteinaggregering 14, betyder det inte att minska tillgängligheten till biotin bindningsficka i streptavidin, vilket görtvärbundet harts som lämpar sig för rening av Strep-inmärkt fusionsproteiner. Det bör noteras emellertid att kemisk tvärbindning av proteiner med biologisk aktivitet (antikroppar, etc.) stabiliserar både aktiva och inaktiva proteinkonformationer, vilket leder till en viss aktivitetsförlust. Till exempel, den väletablerade immunoutfällning metod med användning BS3-tvärbundet antikroppar ger en lägre målprotein utbyte jämfört med den som erhålls med icke-tvärbundna antikroppar 15. Trots detta är en viss förlust av biologisk aktivitet anses vara en acceptabel kompromiss för den förbättrade prov renhet. Vi har observerat liknande resultat med BS3-tvärbundet Strep-Tactin harts. Den något lägre protein avkastning erhålls med den tvärbundna harts var mer än kompenseras av kraftigt förbättrad prov renhet (Figur 6).

En annan möjlig tillämpning av den föreslagna metoden är i rening av Strep-märkta membranproteiner solubilized med tvättmedel. Rengöringsmedel är nödvändiga för att hålla sådana hydrofoba proteiner och deras tillhörande komplex i lösning, men deras närvaro kan leda till kontamination med Strep-Tactin frigörs från affinitetsharts. Ett bra exempel på detta är den rening av en Strep-(II)-märkta membranprotein Vid NTT1 på Strep-Tactin pärlor i syfte att proteinkristallisering 8. Närvaron av detergenten laurylamidodimethylpropylaminoxide (LAPAO) i elueringsbufferten ledde till frisättning av Strep-Tactin från kulorna och den efterföljande tillväxten av oönskade Strep-Tactin kristaller 8. Stabilisering av hartskopplade Strep-Tactin tetramer genom kovalent tvärbindning kan ge ett effektivt sätt att lösa detta problem.

Sammanfattningsvis har kemisk tvärbindning med framgång använts för att övervinna de begränsningar som är förknippade med denaturerande eluering från Strep-Tactin harts. Detta tillvägagångssätt hjälpte uppnå god målprotein recoveryen utan införande av provkontaminering. Den föreslagna metoden kan således användas för att identifiera specifika bindningspartners av twin-Strep-inmärkt betesproteiner genom masspektrometri. Vidare kan metoden appliceras för att isolera och karakterisera kärnproteinkomplex, inklusive sådana reversibelt tvärbunden med formaldehyd, liksom membranproteiner solubiliserats med detergenter. Slutligen innehåller kemisk tvärbindning inte signifikant ändrar de fysikaliska egenskaperna hos Strep-Tactin harts, vilket gör det tvärbundna hartset potentiellt lämplig för hög genomströmning applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi erkänner tacksamt tekniskt stöd från Sini Miettinen, Minna Pöllänen och Taru Rautavesi. Vi tackar Helka Nurkkala för att ge HEK 293 celler som uttrycker twin-Strep-märkta GFP och Pekka Evijärvi för att ge ljudinspelningsutrustning. Detta arbete har finansierats av Finlands Akademi, beviljar nummer 138329, 134.684 och 258.978.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2 mg Pierce/Thermo Scientific 21585 www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection.
Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) IBA 2-1505 www.iba-lifesciences.com
Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile Costar (Corning) 8163 www.corning.com/lifesciences/
Dolphin-nose tubes Costar (Corning) 3213 www.corning.com/lifesciences/
Avidin  IBA 2-0204 www.iba-lifesciences.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10, (8), 975-982 (1997).
  2. Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2, (6), 1528-1535 (2007).
  3. Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5, (5), 1199-1203 (2005).
  4. Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22, (2), 523-535 (2010).
  5. Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  6. Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55, (1), 135-147 (2004).
  7. Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146, (2), 418-430 (2008).
  8. Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68, (10), 1272-1277 (2012).
  9. Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, (7), 2190-2194 (1989).
  10. Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168, (6), 965-974 (2005).
  11. Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281, (50), 38266-38275 (2006).
  12. Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (9), (2010).
  13. Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
  14. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173, (3), 530-540 (2011).
  15. Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics