Organotypic Cocultures में Thalamocortical Axon बंटी और Synapse गठन का दृश्य

Neuroscience

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Summary

यह प्रोटोकॉल cocultures और सेरेब्रल thalamus के organotypic प्रांतस्था में thalamocortical axon शाखाओं और synapse गठन की एक साथ इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है । व्यक्तिगत thalamocortical axons और उनके presynaptic टर्मिनलों DsRed और GFP-टैग synaptophysin के साथ एक एकल सेल electroporation तकनीक द्वारा कल्पना कर रहे हैं ।

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Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

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Abstract

Axon शाखाकरण और synapse गठन सटीक न्यूरॉन सर्किट स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रिया कर रहे हैं. विकास के दौरान संवेदी thalamocortical (टीसी) axons फार्म शाखाओं और सेरेब्रल प्रांतस्था की विशिष्ट परतों में synapses. axon बंटी और synapse गठन के बीच स्पष्ट स्थानिक सहसंबंध के बावजूद, उनके बीच कारण संबंध खराब समझ है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम हाल ही में शाखाकरण और organotypic cocultures में व्यक्तिगत टीसी axons के synapse गठन के एक साथ इमेजिंग के लिए एक विधि विकसित की है ।

इस प्रोटोकॉल एक विधि है जो एक organotypic coculture और electroporation का एक संयोजन के होते है वर्णन करता है । thalamus और सेरेब्रल प्रांतस्था के Organotypic cocultures जीन हेरफेर और axonal प्रक्रियाओं के अवलोकन की सुविधा, ऐसी लामिना विन्यास के रूप में विशिष्ट संरचनाओं के संरक्षण. दो अलग plasmids एंकोडिंग DsRed और EGFP-टैग synaptophysin (SYP-EGFP) transfected ंयूरॉंस की एक छोटी संख्या में एक thalamic तकनीक से सह electroporation थे । इस विधि हमें टीसी ंयूरॉंस की व्यक्तिगत axonal morphologies और उनके presynaptic साइटों एक साथ कल्पना करने की अनुमति दी । विधि भी लंबी अवधि के अवलोकन जो axon शाखाओं और synapse गठन के बीच कारण संबंध से पता चला सक्षम होना चाहिए ।

Introduction

स्तनधारी मस्तिष्क में thalamocortical (टीसी) प्रक्षेपण axon मार्गदर्शन और लक्ष्यीकरण तंत्र की जांच करने के लिए एक उपयुक्त प्रणाली है । विकास के दौरान, संवेदी टीसी axons cortical प्लेट में वृद्धि, और फार्म शाखाओं और synapses को तरजीही रूप से मस्तिष्क प्रांतस्था1में प्राथमिक संवेदी क्षेत्रों की परत चतुर्थ में,2। यहां तक कि मौलिक कनेक्शन की स्थापना के बाद, axonal arbors और synaptic टर्मिनलों पर्यावरण परिवर्तन3,4के आधार पर remodeled कर रहे हैं । हालांकि, कैसे तृकां axon आकृति विज्ञान गतिशील बदल जाता है खराब समझ है । मुख्य कारणों में से एक एक पर्याप्त तकनीक की कमी के लिए एक एकल कोशिका स्तर पर संरचनात्मक परिवर्तन का निरीक्षण है । हालांकि इस तरह के दो के रूप में माइक्रोस्कोपी में हाल की घटनाओं, फोटॉन माइक्रोस्कोपी, vivo मेंcortical न्यूरॉन्स जीने के प्रत्यक्ष अवलोकन की अनुमति दी है, वहाँ अभी भी कर रहे हैं समग्र टीसी पथ पर कब्जा करने के लिए तकनीकी सीमाओं5, 6. इसलिए, टीसी axons के लाइव इमेजिंग के लिए इन विट्रो तरीकों में axon शाखाओं और synapse गठन के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करेगा ।

पहली बार के लिए हमारे समूह पारगंय झिल्ली7के साथ एक स्थिर स्लाइस संस्कृति विधि की स्थापना की । इस विधि का उपयोग करते हुए, एक चूहे cortical स्लाइस एक संवेदी thalamic ब्लॉक के साथ cocultured था, और लेमिना-विशिष्ट टीसी कनेक्शन इस recapitulated organotypic7,8में cocultures थे । विरल एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल आगे हमें टीसी axon विकास और शाखा गठन9,10,11निरीक्षण करने की अनुमति दी । हाल ही में, हम शाखाकरण और organotypic cocultures12में व्यक्तिगत टीसी axons के synapse गठन के एक साथ इमेजिंग के लिए एक उपंयास विधि विकसित की है । TC axons और presynaptic साइटों को एक साथ कल्पना करने के लिए, DsRed और EGFP-टैग synaptophysin (SYP-EGFP) transfected thalamic के electroporation ंयूरॉंस की एक छोटी संख्या में सह organotypic थे । वर्तमान विधि टीसी axons के रूपात्मक विश्लेषण की सुविधा और लंबी अवधि के अवलोकन, जो axon शाखाओं में बंटी और synapse गठन के बीच कारण संबंध दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

सभी प्रयोगों ओसाका विश्वविद्यालय और जापान तंत्रिका विज्ञान सोसायटी की पशु कल्याण समितियों द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया ।

1. thalamus और सेरेब्रल प्रांतस्था के Organotypic cocultures

नोट: विस्तृत कार्यविधि के लिए, मूल प्रकाशन7,8,13का संदर्भ लें । सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए । Sprague-Dawley (SD) चूहों का प्रयोग न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए किया जाता है ।

  1. रिएजेंटों की तैयारियां
    नोट: निम्नलिखित एजेंट के संस्करणों एक चूहे मस्तिष्क के लिए कर रहे हैं ।
    1. 10x संशोधित N2 पूरक तैयार 13: इंसुलिन (50 μg/एमएल), प्रोजेस्टेरोन (200 एनएम), hydrocortisone (200 एनएम), सोडियम selenite (300 एनएम), कैल्सीटोनिन (1 मिलीग्राम/एमएल), putrescine (1 मिमी), ग्लूकोज (60 मिलीग्राम/
    2. सीरम युक्त संस्कृति माध्यम तैयार करें (10 मिलीलीटर): 85% DMEM/F12, 10% 10x संशोधित N2 पूरक, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)
    3. सीरम मुक्त संस्कृति मध्यम तैयार (20 मिलीलीटर): 90% DMEM/F12, 10% 10x संशोधित N2 अनुपूरक
    4. तैयार चूहा पूंछ कोलेजन समाधान (0.5 मिलीलीटर) । संक्षेप में, बाँझ शर्तों के तहत एक चूहे की पूंछ से निविदा फाइबर ले और एसिटिक एसिड समाधान में रात भर गर्मी । केंद्रापसारक के बाद, supernatant इकट्ठा (कुछ मिलीग्राम/एमएल) और एक फ्रिज में स्टोर13
  2. संस्कृति व्यंजन की तैयारी
    1. एक 35 मिमी पेट्री डिश में एक झिल्ली डालने प्लेस ।
    2. जोड़ें 40-चूहा पूंछ कोलेजन समाधान के 50 μL झिल्ली को, और केंद्र के चारों ओर कोलेजन समाधान फैल गया ।
    3. हवा एक साफ पीठ में पूरी तरह से झिल्ली सूखी ।
    4. डिश में सीरम युक्त कल्चरल मीडियम की 1.5-2 मिलीलीटर डाल दें, जिससे झिल्ली मध्यम से लथपथ हो जाए ।
    5. एक मशीन में संस्कृति पकवान प्लेस (37 ° c, humidified 95% हवा, और 5% सह2) चढ़ाना से पहले ।
  3. cortical स्लाइस की तैयारी
    1. 10 मिनट या उससे अधिक समय के लिए 70% इथेनॉल के साथ सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों निष्फल ।
    2. एक जन्मोत्तर दिन से पूरे मस्तिष्क जल्दी काटना (पी) 2 बर्फ के तहत चूहा-ठंडा संज्ञाहरण (कुछ मिनट के लिए बर्फ चिप्स में डूबे) ।
    3. एक 100 mm पेट्री कोल्ड हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान के 100 मिलीलीटर युक्त पकवान में मस्तिष्क प्लेस ।
    4. पिया बात ठीक संदंश के साथ मस्तिष्क से निकालें, और microsurgical कैंची के साथ दृश्य और somatosensory प्रांतस्था से cortical स्लाइसें (300-400 माइक्रोन मोटाई) में कटौती (विस्तार के लिए, चित्रा 1देखें) ।
      नोट: cortical स्लाइस की मोटाई मोटे तौर पर एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत ग्रिड के पैमाने से अनुमानित है ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, cortical स्लाइस बाँझ शर्तों के तहत एक vibratome के साथ बनाया जा सकता है ।
    5. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट के साथ झिल्ली डालने पर कुछ cortical स्लाइस स्थानांतरण.
    6. एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ संस्कृति डालने के केंद्र के पास स्लाइस की स्थिति को समायोजित करें (विवरण के लिए,8,13देखें) और संमिलित करें से अतिरिक्त मध्यम निकालें ।
      नोट: मध्यम के स्तर को स्लाइस की सतह से थोड़ा नीचे समायोजित करें ताकि स्लाइस गैस और मध्यम दोनों की पर्याप्त आपूर्ति प्राप्त कर सकें । यह कोशिका व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है ।
    7. humidified 95% हवा और 5% CO2, और एक दिन के लिए अकेले संस्कृति में 37 ° c पर सीरम युक्त संस्कृति माध्यम में स्लाइस को बनाए रखने के लिए एक thalamic ब्लॉक से पहले ले लिया और इसे अगले रखा जाता है ।
  4. thalamic ब्लॉकों की तैयारी
    1. 10 मिनट या उससे अधिक समय के लिए 70% इथेनॉल के साथ सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों निष्फल ।
    2. Anesthetize एक गर्भवती चूहा (भ्रूण दिवस 15) pentobarbital के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा संवेदनाहारी युक्त (50 मिलीग्राम/
    3. गर्भाशय सींग से प्रत्येक भ्रूण काटना, और एक 100 मिमी पेट्री ठंड ' हैंक्स संतुलित नमक समाधान के 100 मिलीलीटर युक्त पकवान में भ्रूण जगह है ।
    4. एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक भ्रूण से मस्तिष्क को हटाने और thalamic ब्लॉक जो मुख्य रूप से ventrobasal जटिल और पार्श्व geniculate नाभिक (लगभग 0.5 मिमी x 3)7 microsurgical कैंची का उपयोग कर ( चित्रा 1देखें) शामिल कटौती ।
  5. कल्चर और मेन्टेन organotypic cocultures
    1. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, thalamic ब्लॉक cortical स्लाइस जो झिल्ली फिल्टर पर रखा गया है की वेंट्रिकुलर सतह के बगल में रखें ।
    2. humidified 95% हवा और 5% सह के एक वातावरण में 37 ° c पर सीरम युक्त संस्कृति माध्यम में cocultures बनाए रखें2
    3. संस्कृति में दो दिनों के बाद सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम के साथ माध्यम का आदान-प्रदान आधा । इसके बाद, मध्यम हर 2-3 दिन विनिमय ।
      नोट: मध्यम विनिमय के बाद मध्यम का स्तर जांचा जाना चाहिए, क्योंकि यह कोशिका अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है ।

2. Electroporation

सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।

नोट: electroporation एक दिन thalamic ब्लॉकों की तैयारी के बाद ब्लॉकों की टुकड़ी को रोकने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।

  1. plasmids
    1. plasmids का मिश्रण इस प्रकार बनाएं: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      नोट: एक endotoxin मुक्त Maxiprep किट का उपयोग कर दोनों plasmids शुद्ध और हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान में भंग.
  2. Electroporation उपकरण सेटअप
    बिजली के उपकरणों जैसे एक उत्तेजक और एक अलग से जुड़ा होना चाहिए के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है ।
    1. biphasic अलग करने के लिए उत्तेजित करता है कनेक्ट ।
    2. एक इलेक्ट्रोड कनेक्ट (एक चांदी के तार 0.2 mm व्यास) के लिए अलग से नकारात्मक टर्मिनल ।
    3. श्रृंखला में एक इलेक्ट्रोड (एक चांदी के तार 1 मिमी व्यास) एक 100 Ω रोकनेवाला और अलग से सकारात्मक टर्मिनल के लिए कनेक्ट.
    4. विद्युत धाराओं रोकनेवाला में एम्पलीफायर के साथ वोल्टेज को मापने के द्वारा पारित कर रहे हैं कि क्या निगरानी करने के लिए आस्टसीलस्कप के लिए एम्पलीफायर कनेक्ट.
  3. ग् पिपेट की तैयारी
    नोट: ग्लास पिपेट के दो प्रकार के प्लाज्मिड समाधान और विद्युत दालों के आवेदन के इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है ।
    1. एक इलेक्ट्रोड खींचने के साथ कांच केशिकाओं से पिपेट बनाओ ।
    2. इंजेक्शन पिपेट के लिए टिप तोड़ (टिप व्यास 20-50 माइक्रोन होना चाहिए) ।
    3. आग चमकाने के बाद सैड के साथ इलेक्ट्रोड पिपेट की नोक को पीस लें और पॉलिश करें (भीतरी व्यास 50-200 माइक्रोन होना चाहिए) ।
      नोट: इलेक्ट्रोड टिप सपाट और चिकनी होना चाहिए, के रूप में यह सीधे ऊतकों को छू लेती है.
  4. electroporation की प्रक्रिया
    1. इंजेक्शन और इलेक्ट्रोड पिपेट को जोड़ियों से कनेक्ट करें ।
    2. इलेक्ट्रोड पिपेट में एक चांदी के तार (0.2 mm व्यास) डालें ।
    3. एक प्लास्टिक ट्यूब के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए इंजेक्शन पिपेट संलग्न करें ।
    4. ऊपर उठाएं > 5 प्लाज्मिड समाधान के μL इंजेक्शन सिरिंज द्वारा पिपेट में ।
    5. electroporation मंच पर coculture रखो, और संस्कृति माध्यम में 1 मिमी व्यास इलेक्ट्रोड डालें ।
    6. thalamic explant पर बेदखली पिपेट को रखें ।
    7. टिप thalamic ब्लॉक की सतह को छू लेने के बाद मैन्युअल रूप से सिरिंज पुश.
      नोट: प्लाज्मिड समाधान के बारे में 0.5 μL आमतौर पर एक thalamic ब्लॉक प्रति प्रयोग किया जाता है ।
    8. इलेक्ट्रोड पिपेट thalamic ब्लॉक पर तुरंत बेदखली पिपेट की कर्षण के बाद रखें ।
    9. बिजली दालों उद्धार (50-400 μA, 200 हर्ट्ज पर 1 एमएस अवधि के 200 वर्ग दालों की 3 से 5 गाड़ियों). आयाम और आस्टसीलस्कप पर गाड़ियों की संख्या की निगरानी ।
      नोट: विद्युत धाराओं के आयाम एक इलेक्ट्रोड पिपेट के भीतरी व्यास पर निर्भर करता है13.
    10. इलेक्ट्रोड पिपेट वापस लेना और मशीन के लिए पकवान वापसी ।
  5. सूक्ष्म अवलोकन
    1. EGFP के लिए दो फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप की एक सूक्ष्म मंच पर संस्कृति पकवान रखो (उत्तेजना, 488 एनएम; उत्सर्जन, 515 एनएम) और DsRed (उत्तेजना, 514 एनएम; उत्सर्जन, 565 एनएम) ।
    2. एक 20X लंबे समय से काम कर दूरी उद्देश्य लेंस के साथ 1-7 µm-कदम आकार पर 10-25 ऑप्टिकल वर्गों की छवियों को ले लो । व्यक्तिगत रूप से विशिष्ठ लेबल axons जो दोनों DsRed और SYP-EGFP व्यक्त का चयन करें ।
      नोट: मनाया क्षेत्र लगभग 0.7 x 0.7 mm है (संगत 1024 x 1024 पिक्सल, कि है, ०.६८ माइक्रोन/पिक्सेल) ।
    3. दैनिक इमेजिंग के लिए हर 24 घंटे छवियों पर कब्जा । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के भीतर पूरा करें, और मशीन के लिए संस्कृतियों वापस । कम अंतराल समय चूक इमेजिंग के लिए, एक संस्कृति कक्ष, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified 95% हवा और 5% सह के पर्यावरण का कहना है में संस्कृति रखने के लिए ।

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Representative Results

प्रयोग यहां वर्णित टीसी axon शाखाओं में बंटी और synapse गठन के बीच संबंध प्रकट करना है । एक साथ axonal पथ और presynaptic साइटों के स्थानों की कल्पना करने के लिए, organotypic cocultures में एकल या कुछ thalamic कोशिकाओं को दो transfected एंकोडिंग plasmids-SYP और EGFP का उपयोग DsRed के साथ electroporation थे । संस्कृति में दूसरे सप्ताह के दौरान, व्यक्तिगत रूप से विशिष्ठ टीसी axons स्पष्ट रूप से DsRed (चित्रा 3) द्वारा लेबल थे. केवल अवलोकन के लिए DsRed और SYP-EGFP का प्रदर्शन करने वाले axons का चयन किया गया । लेबल टीसी axons cortical स्लाइस पर आक्रमण किया और मुख्य रूप से ऊपरी परतों में शाखाओं का गठन, यह दर्शाता है कि organotypic cocultures फार्म शाखाओं में लामिना विशिष्टता है कि vivo7में पाया के साथ thalamic axons, 8,10,14,15,16,17. एक ही समय में, SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) के कबरा एग्रीगेट DsRed-लेबलेड टीसी axons (चित्रा 3डी-3F) के साथ मनाया जा सकता है । चूंकि ये SYP-EGFP puncta ज्यादातर immunopositive के लिए VGLUT2 संकेतों के साथ colocalized थे, जो presynaptic कोशिकाओं का thalamic मार्कर है, और PSD95 के लिए, जो एक सामान्य postsynaptic मार्कर है, यह संभावना है कि SYP-EGFP puncta ज्यादातर presynaptic का प्रतिनिधित्व करते हैं टीसी axons पर साइटें12

समय-चूक टीसी axons की इमेजिंग आगे पता चला कि axon शाखाओं में बंटी और thalamic ंयूरॉंस के synapse गठन और इसके अलावा और उंमूलन के साथ सतत और गतिशील थे (चित्रा 4)12। इसके अलावा, अधिकांश शाखाओं को SYP-EGFP puncta से उभरने के लिए पाया गया, यह दर्शाता है कि presynaptic साइटें शाखा के गठन को ट्रिगर करतीं हैं (विवरण के लिए,12देखें) ।

Figure 1
चित्र 1 . thalamus और सेरेब्रल प्रांतस्था के एक organotypic cocultures की तैयारी के लिए प्रक्रिया. () एक नवजात चूहे मस्तिष्क के शीर्ष दृश्य । पहली कटौती midline (1) के समानांतर बनाई गई है । फिर, 300-500-माइक्रोन-मोटी राज्याभिषेक वर्गों को प्राथमिक दृश्य और somatosensory प्रांतस्था (2) से काट रहे हैं । अंत में, एक parasagittal कटौती करने के लिए cortical स्लाइस (3) प्राप्त करने के लिए । (B) thalamus और सेरेब्रल प्रांतस्था के एक organotypic coculture का एक योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । जन्मोत्तर दिन से Cortical स्लाइसें 2 चूहे और भ्रूण दिन 15 से thalamic ब्लॉकों झिल्ली फिल्टर पर cocultured हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . electroporation के लिए बिजली के उपकरणों की एक योजनाबद्ध आरेख। उत्तेजक, अलग, और इलेक्ट्रोड पिपेट श्रृंखला में जुड़े हुए हैं. नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए देने के लिए, इलेक्ट्रोड पिपेट के लिए अलग से नकारात्मक टर्मिनल से जुड़ा है. electroporation के लिए विद्युत धाराओं आस्टसीलस्कप के साथ नजर रखी जा सकती है । ध: thalamus. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद एक coculture में Thalamocortical axons । (-) एक thalamocortical (टीसी) axon में DsRed के साथ SYP-EGFP का Coexpression । DsRed plus SYP-EGFP plasmids thalamic का उपयोग करते हुए इन विट्रो (DIV) में 1 दिन में कल्चरल electroporation कोशिकाओं में पेश किया गया । (क) एक organotypic coculture के बाद thalamic और cortical स्लाइसें 12 DIV. (ख) एक DsRed-लेबल thalamic सेल axon टुकड़ा और ऊपरी परतों में रूपों शाखाओं में एक cortical फैली हुई है । (ग) में बॉक्सिंग क्षेत्र की एक बढ़ाया छवि (क)(d-F) DsRed-लेबल किए गए TC axon (d) और SYP-EGFP puncta (E) के बॉक्स्ड क्षेत्र में (C)दिखाएं । SYP के असतत संचय-EGFP एक भी टीसी axon साथ मनाया गया । ध: thalamus. स्केल बार्स: (B) 1 मिमी, (ग) 100 µm, और (F) 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 . एक thalamocortical axon के समय-चूक इमेजिंग एक DsRed organotypic में SYP-EGFP और coculture व्यक्त । DsRed प्लस SYP-EGFP plasmids 1 DIV thalamic का उपयोग कर में संस्कृतिपूर्ण electroporation कोशिकाओं में पेश किया गया । इस axon दैनिक 4 दिन (11 div करने के लिए 14 div) पर छवि थी । स्केल बार: 50 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल भी एक शक्तिशाली को टीसी प्रक्षेपण11के अलावा अंय axons बढ़ती के विकास के पहलुओं का अध्ययन उपकरण है । उदाहरण के लिए, cortical टुकड़ा संस्कृति का एक संयोजन और electroporation तकनीक की अनुमति देता है visualizing cortical ंयूरॉंस और दीर्घकालिक प्रेक्षण के9,18के व्यक्तिगत axonal आकृति विज्ञान ।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके, axon शाखाओं में दिलचस्प जीन की भूमिकाओं और synapse गठन भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ब्याज जीन की सह अभिव्यक्ति द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । आमतौर पर, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के 90% से अधिक सह रहे है एक दूसरे प्लाज्मिड के साथ transfected जब प्लाज्मिड समाधान के दाढ़ अनुपात 1:218,19के लिए समायोजित है । हालांकि, इष्टतम अनुपात सह के रूप में अलग हो सकता है अभिकर्मक प्रभावकारिता और अभिव्यक्ति स्तर वैक्टर के बीच विविध रहे हैं ।

हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल समय चूक प्रयोगों के लिए कुशल है, वहां कुछ तकनीकी समस्याएं हैं । डेली इमेजिंग के लिए, एक coculture हर दिन एक सूक्ष्म मंच पर रखा गया था । हालांकि axonal विकास को गंभीरता से दैनिक इमेजिंग द्वारा प्रभावित नहीं किया10लगता है, प्रत्येक अवलोकन 10 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए संस्कृति समाधान और संस्कृति माध्यम के पीएच में परिवर्तन के वाष्पीकरण को कम करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, यह सूक्ष्म चरण12पर संस्कृतियों के तापमान, आर्द्रता और पीएच बनाए रखने के लिए बेहतर होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम भी महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए गेब्रियल हाथ धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335, (1), 123-148 (1993).
  2. Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4, (4), 276-289 (2003).
  3. Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75, (2), 230-249 (2012).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (8), 272 (2005).
  5. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10, (9), 647-658 (2009).
  6. Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
  7. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245, (4914), 192-194 (1989).
  8. Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9, (2), 217-228 (1992).
  9. Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25, (1), 1-9 (2005).
  10. Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27, (19), 5215-5223 (2007).
  11. Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50, (6), 475-477 (2008).
  12. Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76, (3), 323-336 (2016).
  13. Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. 159-168 (2015).
  14. Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351, (6326), 475-477 (1991).
  15. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12, (8), 3054-3070 (1992).
  16. Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20, (24), 9145-9151 (2000).
  17. Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42, (1), 56-68 (2000).
  18. Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28, (37), 9117-9121 (2008).
  19. Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (16), 7562-7567 (2010).

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