Rimozione meccanica della membrana corionica e vitellina: un metodo per preparare gli ovociti drosophila per l'osservazione diretta

Overview

Questo video descrive un metodo per rimuovere meccanicamente le membrane corali e vitelline dagli ovociti Drosophila maturi precedentemente fissati. Il protocollo in primo piano mostra una dimostrazione dettagliata della procedura che produce ovociti compatibili con i test di ibridazione in situ fluorescenti.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Perkins e Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017).

1. Rimozione dei colinoni e delle membrane vitelline

NOTA: Vedere la figura 1 per gli strumenti necessari.

1. Ovociti separati in fase avanzata
   1. Aggiungere 1 mL PBSBTx a una sezionatura superficiale. Utilizzare un P200 con una punta rivestita in BSA per trasferire ovaie fisse (in ~ 150 μL) nel piatto poco profondo. Ovaie di pipetta su e giù con la punta della pipetta rivestita in BSA per spodestare gli ovociti maturi dagli ovociti meno maturi.
   2. Quando gli ovociti in fase avanzata sono sufficientemente separati, trasferire tutto il tessuto in un tubo di microfugo da 500 μL. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta Pasteur tirata, lasciando circa 150 - 200 μL nel tubo. Ripetere la sezione 1.1 per i genotipi rimanenti.
2. Prepararsi per il rotolamento
   1. Pre-bagnare un piatto profondo con 200 μL di PBSBTx. Coprire e mettere da parte. Ottenere 3 vetri smerigliati e mettere da parte #3 scivolo. Strofinare delicatamente le regioni di vetro smerigliato degli #1 e #2 insieme. Risciacquarli in acqua deionizzata per rimuovere eventuali frammenti di vetro e asciugarli con una salvietta usa e getta.
   2. Rivestire le regioni smerigliate delle diapositive #1 e #2 con PBSBTx aggiungendo 50 μL di PBSBTx a una diapositiva e strofinando questa regione con l'altra diapositiva. Rimuovere il liquido con una salvietta monouso.
   3. Posizionare le diapositive al microscopio di sezionamento nella configurazione illustrata nella figura 2A. Mantenere in contatto le aree smerigliate #1 diapositive #2, con diapositive che #3 le diapositive #2.
3. Roll ovociti; assicurarsi che la direzione di laminazione sia sempre in linea retta e mai un movimento circolare.
   1. Prewet una punta di pipetta P200 in PBSBTx e disperdere gli ovociti nel tubo di microfugo tubazioni su e giù. Trasferire 50 μL di liquido contenente ovociti al centro della parte in vetro smerigliato del vetro #1. Sollevare lo #2 per eseguire questa questa situazione.
   2. Abbassare lentamente lo #2 fino a quando la tensione superficiale del liquido crea una tenuta tra le due regioni di vetro smerigliato. Ci dovrebbe essere abbastanza liquido per coprire l'area smerigliata, ma nessuno dovrebbe essere in uscita. Se il liquido è traboccante, utilizzare una pipetta Pasteur tirata per rimuovere il liquido in eccesso.
   3. Tenere la diapositiva inferiore (#1) in posizione con una mano e usare l'altra mano per spostare la diapositiva superiore (#2) avanti e indietro in direzione orizzontale, mantenendo la diapositiva #2 livello e supportata su #3. Eseguire al microscopio per una facile visualizzazione dei movimenti e dei progressi degli ovocici.
      NOTA: Questo movimento genererà attrito e farà "rotolare" gli ovociti e perderà i loro corioni. Dovrebbe essere utilizzata una pressione minima e i movimenti dovrebbero essere brevi e veloci.
   4. Dopo alcuni movimenti in direzione orizzontale, modificare leggermente l'angolo di movimento (Figura 2B). Con incrementi multipli, aumentare gradualmente questo angolo a 90° fino a quando il movimento della diapositiva superiore (#2) è perpendicolare alla direzione iniziale (Figura 2B). Si noti che i corioni vuoti saranno visibili nel liquido e gli ovociti privi di corioni appariranno sempre più lunghi.
   5. Ripetere i passaggi da 1.3.3 - 1.3.4 circa 7 - 10 volte fino a quando la soluzione diventa leggermente nuvolosa. Smettere di rotolare quando la maggior parte degli ovociti (75 - 85%) sembrano aver perso le loro membrane vitelline.
      NOTA: Un'estremità appuntita distintiva è spesso visibile sugli ovociti privi di membrane vitelline. Le membrane vitelline sono più difficili da rimuovere rispetto ai corrioni. La pressione leggera può essere applicata allo scivolo superiore (#2) durante la laminazione per ottenere la rimozione delle membrane vitelline. Cercare di rimuovere le membrane vitelline da tutti gli ovociti spesso comporta la distruzione di altri ovociti.
   6. Sollevare delicatamente lo scivolo superiore (#2), trascinando uno dei suoi angoli al centro della regione smerigliata dello scivolo inferiore (#1) in modo che gli ovociti arrotolati si accumulino al centro della regione smerigliata. Risciacquare gli ovociti da entrambe le diapositive con PBSBTx nel piatto profondo contenente PBSBTx.
   7. Gli scivoli puliti #1 e #2 con acqua ultrapura, asciugare con una salvietta usa e getta e resettare. Ripetere i passaggi da 1.3.1 a 1.3.6 fino a quando non sono stati laminati tutti gli ovociti dello stesso genotipo. Questo di solito richiede da 3 a 4 cicli di laminazione per genotipo.
4. Rimuovere i detriti dopo il rotolamento
   1. Aggiungere 1 mL PBSBTx a un tubo conico da 15 ml. Ruotare il liquido per rivestire i lati del tubo.
   2. Utilizzando una punta di pipetta P1000 rivestita in PBSBTx, trasferire gli ovociti laminati dalla piastra del pozzo profondo al tubo conico contenente 1 ml di PBSBTx. Aggiungere altri 2 ml di PBSBTx al tubo conico contenente gli ovociti.
   3. Lasciare che gli ovociti inizino a depositarsi sul fondo, quindi rimuovere i primi 2 mL di soluzione contenenti detriti (coriaci, vitellini, ecc.)con un P1000 e scartare. Se necessario, tenere il tubo conico su uno sfondo scuro per vedere gli ovociti opachi mentre affondano.
   4. Aggiungere altri 2 mL di PBSBTx agli ovociti e ripetere il passaggio 1.4.3. Ripetere 1.4.3. per un totale di 3 cicli di rimozione dei detriti.
   5. Utilizzando una punta di pipetta P1000 rivestita in PBSBTx, trasferire gli ovociti nel tubo originale di microfugo da 500 μL. 20-25 femmine devono produrre circa 50 μL di ovociti maturi laminati.
5. Ripetere la sezione 4 per i genotipi rimanenti utilizzando scivoli smerigliati freschi, un piatto pulito e profondo e un nuovo tubo conico per ogni genotipo.
6. Se lo stoccaggio è necessario, trasferire gli ovociti in 1x PBS con tritionX-100 allo 0,1% e conservare durante la notte a 4 °C. Lo stoccaggio a lungo termine non è raccomandato perché il collegamento incrociato della formaldeide può essere invertito da detergenti non ionici.

Representative Results

Figura 1: Strumenti di citologia. Strumenti utilizzati nel protocollo: (1) coppia di forcep (#5 Dumont); 2) ago di tungsteno; (3) piatto profondo con copertura; 4) sezionare il vetro superficiale; (5) pipetta Pasteur tirata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Disposizione e movimento delle diapositive per gli ovociti laminazione. (A) Diagramma della diapositiva allestita per la laminazione degli ovociti come descritto nel protocollo. L'area più scura denota la parte in vetro smerigliato dello scivolo. (B) Direzione dei vettori di movimento per la #2 durante la laminazione degli ovocite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9" Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Tungsten needle			homemade
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
15 mL conical tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
Kimwipes	Various		disposable wipes