Larve lymfekirtler dissektion: Isolere Drosophila Hemocyte-producerende organ

Overview

Denne video beskriver Drosophila lymfekirtlen-det primære sted for hæmatopoiesis i flue larven-og viser et eksempel protokol til at dissekere og montere organet for immunohistochemistry og fluorescerende billeddannelse.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Reimels og Pfleger, Metoder til at undersøge lymfekirtlen og hæmocytterne i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2016).

1. Larve lymfekirtler Immunohistochemistry

BEMÆRK: Lymfekirtlen er placeret cirka en tredjedel længde fra den forreste ende af en larve lidt under hjernen på dorsalsiden. (Se pilen i figur 1B). Lymfeknuderne flankerer det dorsale kar og dissekeres lettest fastgjort til mundkrogene eller hjernen. Wild-type, tredje instar lymfekirtler er meget små strukturer; de primære lobes er ca. 100 - 200 μm i længden. (Se figur 2A.

1. For at opnå larver af omtrent samme udviklingsstadium til denne analyse, begrænse ægopsamlingen ved at tillade kvinder at lægge æg i en fast periode på 2 - 6 timer.
2. Lymfeknuder dissektion
   1. For hver forsøgstilstand tilsættes 1 ml 1x PBS (tabel 1) til en brønd af en 24-brønds plade.
   2. Der tilsættes 1 dråbe 0,1% PBST (Tabel 1) til hver brønd ved hjælp af en engangsoverførselspipet.
      BEMÆRK: Vaskemiddel, såsom Tween 20, tilsættes for at sænke overfladespændingen, så vævet kan synke til bunden af brønden.
   3. Placer pladen fladt på is.
   4. Saml larver i dissekere parabol brønde fyldt med 1x PBS.
   5. Placer en ren dissekeringspude på en oplyst stereomikroskopbase. Brug en engangsoverførselspipet til at placere små dråber på 0,01% PBST (Tabel 1) på puden. Overfør en larve til et PBST-fald for dissektion.
   6. Hold larven med et par pincet ca en fjerdedel længde fra den bageste ende, dorsal side op.
   7. Brug et andet par pincet til at få fat i kutikula straks forreste til pincet, der holder larven. Træk forsigtigt neglebåndet mod den forreste ende, indtil mundkrogene er udsat.
      BEMÆRK: Målet er at skrælle neglebåndet uden at forstyrre nogen interne strukturer.
   8. Slip neglebåndet og brug begge pincet til at skære larven i to. Fjern den bageste ende fra PBST drop.
      BEMÆRK: Hvis neglebåndet ikke skræller hele vejen til mundkrogene, skæres larven i to og fjern den bageste ende. Brug et par pincet til at holde kanten af neglebånd, og bruge de andre par pincet til at skubbe munden kroge gennem åbningen. Dette vil vende neglebåndet og udsætte mundkrogene. Dette kan også bruges som en alternativ dissektionsmetode.
   9. Brug et par pinps til at fastgøre neglebåndet (enten den ventrale kutikula, den dorsale neglebåndsklap eller begge dele) for stabilitet.
   10. Brug et andet par pincet til at få fat i de udsatte mundkroge og forsigtigt trække dem ud.
       BEMÆRK: Dette vil adskille kutikula fra de interne strukturer. Ideelt set vil øjen-/antenne-imaginalskiverne, hjernen, ringkirtlen og lymfekirtlen, der flankerer dorsalbeholderen, forblive fastgjort til mundkrogene.
   11. Mens du stadig holder munden kroge, omhyggeligt fjerne uønskede strukturer såsom spytkirtler, fedt krop, og tarmen.
       BEMÆRK: Hvis hjernen adskiller sig fra munden kroge, lymfeknuder kan stadig være knyttet til og indsamlet med hjernen. I dette tilfælde skal du holde den ventrale nerveledning i stedet for mundkrogene.
   12. Brug mundkrogene eller ventral nerveledningen som håndtag, overfør det dissekerede kompleks, der indeholder lymfekirtlen, til brønden på isen. Må ikke overstige 30 minutter før fiksering.
3. Fiksering og immunohistochemisteri
   1. Placer 24-brøndspladen på stereomikroskopbunden.
   2. Brug en p200 pipette til forsigtigt at fjerne PBST fra brønden.
      BEMÆRK: Tomme, tilstødende brønde er nyttige til midlertidigt at deponere affald.
   3. Tilsæt forsigtigt 200 μl 3,7% formaldehyd (tabel 1) ned på siden af brønden og svirr pladen for at sikre, at de dissekerede væv er helt nedsænket.
   4. Sæt pladen på is i 30 minutter. Hvis lymfekirtlerne udtrykker fluorescerende protein(er), skal pladen holdes dækket for at forhindre fotobleaching.
   5. Brug en p200 pipette til forsigtigt at fjerne fikseringsmiddel.
   6. Vask ved at tilsætte 200 μl 1x PBS til brønden og placere pladen på en orbital shaker i 5 minutter ved stuetemperatur. Brug en p200 pipette til forsigtigt at fjerne PBS.
      BEMÆRK: Fast lymfekirtler kan efterlades på is i PBS, indtil lymfekirtler for alle eksperimentelle betingelser er dissekeret og fast.
   7. Gentag vasketrinnene to gange mere.
   8. Der tilsættes 200 μl permeabiliseringsopløsning (tabel 1) til brønden. Sæt pladen på en orbital shaker i 45 min på RT.
      BEMÆRK: 45 min er "guld standard" for lymfekirtlen permeabilization men forfatterne har succes efter kun 20 min.
   9. Fjern opløsningen med en p200 pipette.
   10. Det primære antistof fortyndes med antistofopløsning (tabel 1) i overensstemmelse med udbyderens specifikationer. Der tilsættes 300 μl primær antistofopløsning til brønden, og det sikres, at de dissekerede væv er helt nedsænket. Inkuber ved 4 °C natten over.
   11. Brug en p200 pipette til at fjerne det primære antistof.
   12. Vask ved at tilsætte 200 μl 1x PBS til brønden og placere pladen på en orbital shaker i 10 minutter ved stuetemperatur. Brug en p200 pipette til forsigtigt at fjerne PBS.
   13. Gentag vasketrinnene to gange mere.
   14. Sekundært antistof fortyndes med antistofopløsning i henhold til udbyderens specifikationer. Der tilsættes 300 μl sekundær antistofopløsning til brønden, og det sikres, at de dissekerede væv er helt nedsænket. Inkuber på en orbital shaker i mindst 2 timer på RT.
   15. Brug en p200-pipette til at fjerne det sekundære antistof og vask som beskrevet i trin 1.3.12 og 1.3.13. Fjern ikke PBS'en efter den endelige vask.
4. Lymfeknuder montering
   1. Rene mikroskopdias i glas med 70 % ethanol (tabel 1) og vævsservietter.
   2. For hver forsøgstilstand skal du placere en dråbe monteringsbuffer(tabel 1)på glasrutsjebanen.
      BEMÆRK: Der er plads til to betingelser på ét dias. Montering buffer volumen afhænger af antallet af lymfekirtler, der skal monteres. Brug 2 μl i ca. 18- 20 lymfekirtler, 1 μl for 10 - 12 og 0,5 μl for 5 eller derunder.
   3. Placer mikroskopdiaset på en oplyst stereomikroskopbase.
   4. For op til to betingelser ad gangen, overføre alle lymfekirtler fra brønden til montering buffer med pincet, ved hjælp af munden kroge eller ventral nerve ledningen som et håndtag.
   5. Rum de dissekerede væv jævnt i en cirkulær eller rektangulær form, sprede monteringsbufferen i processen.
   6. For hver af de dissekerede væv, individuelt, skub en tang under dorsal fartøj og forsigtigt trække mod periferien af montering buffer.
      BEMÆRK: Dette vil trække lymfekirtlen ud fra resten af dissekeret væv og flade lymfekirtlen på glasset.
   7. Ved hjælp af en tang og en savbevægelse skæres dorsalkarret mellem lymfekirtlen og hjernen.
   8. Flyt resten af de dissekerede væv til den modsatte side af lymfekirtlen, på den yderste kant af bufferen.
      BEMÆRK: Den uønskede dissekeret væv i sidste ende vil danne en omkreds omkring lymfekirtlerne og tjene som en støtte, som coverslip vil hvile.
   9. Gentag indtil alle lymfekirtlerne er adskilt fra de dissekerede væv og reserverer et af de uønskede dissekerede væv til at placere i midten.
   10. Tag en coverlip mellem to fingre. Kontroller, at coverlip er fri for støv og fingeraftryk. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en vævsservietter og 70% ethanol til at rense coverslip.
   11. Sørg for, at kanten af dækslet er parallelt med kanten af glasrutschebanen, sænk forsigtigt dækslet over monteringsbufferen.
       BEMÆRK: Mikroskopdias kan opbevares ved 4 °C inden billeddannelse. Maksimal opbevaringstid afhænger af stabiliteten af de anvendte antistoffer. 24-brøndsplader kan skylles og genbruges.

2. Billedbehandling

1. Billede faste hæmocytter og monterede lymfekirtler på en passende standard fluorescens eller konfokal mikroskop ved 20X eller højere forstørrelse i henhold til producentens betjeningsvejledning. Billede hele larver på en standard stereomikroskop ved 2X forstørrelse i henhold til producentens betjeningsvejledning.
2. Følg softwareudbyderens instruktioner om dekonvolution, hvis det ønskes.

Representative Results

Figur 1: In Vivo Crystal Cell Melanization. A) Larver blev placeret individuelt i PCR-rør før opvarmning. Røde pile angiver larver, der ikke er i bunden af rørene. B) En typisk krystal celle melanisering mønster efter opvarmning, som undertiden afslører lymfekirtlen (pil; dorsal side vist, forreste er tilbage). Skalalinjen repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Larve LymfekirtimImImtohistochemistry. A) Et DIC-billede af en tredje instar larvelymfekirtel, der viser dorsalbeholderen (dv), primære lapper (1°) og sekundære lobes (2°). Skala bar repræsenterer 100 μm. B) En repræsentativ tredje instar larve lymfeknuder fra en larve genetisk udtryk EBFP2 i medullary zone og GFP i den bageste signalering center. Lymfekirtlen var plettet med et antistof mod Notch intracellulære domæne (rød). Uændret billede taget med et fluorescensmikroskop (øverst). Det samme billede efter dekonvolution (nederst). Skalalinjer repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1