Overview
Drosophila microbiota는 동물의 발달, 면역 및 생리학에 영향을 미칩니다. 이 비디오는 전신 제제에서 식민지 형성 단위를 결정하여 파리에서 박테리아를 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 4종의 세균성 종을 사용하여 노토바이오틱 조건에서 사육된 파리기술을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 코일 외에서발췌, 악삭과 노토바이오틱 조건에서 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터를 사육, J. Vis. Exp. (2016).
1. 계란을 데초리오네이트하고 멸균 식단으로 이전
- 70%의 에탄올로 내부(측면 포함)를 분사하여 생물안전 캐비닛을 준비합니다. 실험실 조직으로 바닥을 닦고 UV 빛으로 후드를 15 분 동안 살균하십시오. 모든 비생물학적 소모품(표본컵, 페인트브러시, 집게, 폐수, 멸균수 400ml, 고가염소산나트륨 100ml)을 에탄올로 분사하고 즉시 바이오 안전 캐비닛에 배치하여 살균합니다. 15 분 동안 UV 빛으로 살균하십시오.
- 120ml 표본 컵 또는 다른 멸균 용기에 계란으로 부시를 배치하여 2 개의 나트륨 hypochlorite 세차제 중 첫 번째를 시작합니다. 0.6% 나트륨 하이포염소용 액액을 0.6% 의 90ml를 서서히 부싱에 붓고 가장자리 바로 아래까지 붓습니다.
- 계란을 2.5분 동안 헹구습니다. 주기적으로 집게를 사용하여 알을 다시 일시 중단하여 하이포염소염 용액에서 부시를 위아래로 움직입니다.
- 부시를 생물 안전 캐비닛 내부에 90ml 표백제로 미리 채워진 두 번째 표본 컵으로 직접 옮기습니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부의 1.3 단계를 반복합니다. 두 번째 표백제 치료가 끝나면 계란은 부싱의 측면을 고수하기 시작해야합니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 1.7-1.8 단계를 수행하십시오.
- 표백제를 버리고 멸균물로 부싱을 3번 씻습니다. 집게로 부싱을 이동하여 각 세척 중에 계란을 여러 번 다시 중단합니다. 세 번째 세척이 끝날 때까지 대부분의 계란은 부싱 의 측면에 부착해야합니다.
- 에탄올에 멸균된 페인트브러시를 사용하여 부싱 측에서 멸균 식단으로 계란을 옮길 수 있습니다. 계란을 개별적으로 또는 소량으로 옮기. 바이알 당 30-50 개의 계란을 목표로하십시오. 산소가 튜브에 들어갈 수 있도록 캡을 느슨하게 둡니다. 바이알이 축축한 상태로 유지된다면 곤충 인큐베이터로 옮기십시오. 그렇지 않으면, 아래와 같이 박테리아를 추가.
2. 4 가지 세균 종을 사용하여 그노토바이오틱 파리를 만듭니다.
- 박테리아 준비
- 1.1단계에서와 같이 필요한 소모품(파이펫, 파이펫 팁 박스, 멸균원원심분리관, MRS 국물 및 테스트 튜브 랙)을 갖춘 멸균 된 생물 안전 캐비닛을 준비하십시오. 생체 안전 캐비닛에 넣기 전에 에탄올에 젖은 실험실 닦아 테스트 튜브의 외부를 닦아.
- 박테리아를 멸균 미생물튜브로 1박 성장의 500 μl을 먼저 이송하여 박테리아를 펠렛합니다. 세균 밀도가 낮은 경우, 각 튜브에 최대 1.5 ml를 추가하거나 순차적으로 상체를 제거하고 동일한 튜브에 추가 배양을 추가합니다. 10,000 x g에서 10 분 동안 생물 안전 캐비닛및 원심 분리기에서 샘플을 제거하십시오. 필터 팁을 사용하여 샘플 간의 오염을 방지합니다.
- OD600을측정하여 각 배양의 밀도를 결정한다. 다중 음판 판독기를 사용하는 경우 각 배양의 200 μl을 1, 2-및 4배 희석으로 96웰 플레이트로 옮기는다.
- 각 셀 펠릿(2.1.2)을 희석시키는 mMRS의 양을 분광계와 다음 방정식을 판독하는 플레이트를 이용하여 결정한다. 각 플라이 바이알에 50 μl을 접종하기에 충분한 국물을 추가할 계획입니다.
- 플레이트 판독 분광계에서 각 세균 배양을 1:1, 1:2 및 1:4 희석에 대한 OD600 판독값을 수집합니다. 0.1과 0.2 사이의 OD600 값을 생성하는 각 세균 균주에 대한 희석을 선택하고 2.1.4.2 또는 2.1.4.3에서 제공되는 수식에서 이 값과 해당 희석 계수를 'O'와 'D'로 사용합니다.
- 여기에 설명된 4종을 사용하는 경우, 세포를 상응하는 식민지 형성 유닛(CFU)/ml 밀도(OD600에서 뉴웰 및 더글러스, Appl Environ Microbiol에서 이전에 결정된 CFU 변환으로 정상화한다. (2014)) 이 방정식을 사용 하 여:
E = ((O-B) x V x D)/C
여기서 E = 부피가 펠릿을 재연하는 곳(μl), O = OD600 박테리아, B = OD600 빈 매체, D = 접이식 희석, V = μl 세균 배양 원심분리, C = 소정의 상수의 OD600. 이러한 방정식을 사용하여 계산의 예를 보려면 추가 코드 파일을 참조하십시오. 자동으로 비워진 분광광계의 경우 "O-B"대신 "O"를 사용하십시오.
참고: 소정의 상수(단위 OD600,107 CFUml-1로정규화, 뉴웰및 더글러스, Appl Environ Microbiol에서 유래된 상수. (2014)) 다음과 같이 다음과 같습니다 : A. tropicalis (0.052), A. 포모럼 (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077). - 다른 세균성 종(CFU/OD600 상수를 사용할 수 없음)을 사용하는 경우 이 방정식을 사용하여 ODI600 = 0.1로 밀도를 정규화합니다.
E = (O-B) x V x D)/0.1 OD600
참고: 단위는 2.1.4.2 단계와 동일합니다. 이러한 방정식을 사용하여 계산의 예를 보려면 추가 코드 파일을 참조하십시오.
- 생물 안전 캐비닛에서, 파이펫 팁으로 상류체를 제거하고 2.1.4.2 단계에서 계산된 신선한 mMRS 또는 PBS에서 펠릿을 재연한다.
- 접종 박테리아
- 박테리아의 50 μl을 멸균 식단과 비반향계란을 생체 안전 캐비닛에 사용하여 원내 튜브로 옮기습니다. 알로알 간 오염을 방지하기 위해 계란 이송 후 박테리아를 추가합니다.
- 25°C의 인큐베이터에 접종된 튜브를 배치합니다.
3. 멸균을 위한 CFU 부하/테스트 측정
- 전신 플라이 균질화의 CFU 부하를 측정하기 위해 5 파리 (5-7 일 후 백과) 세라믹 구슬 125 μl 및 mMRS 국물의 125 μl을 포함하는 1.7 ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮기십시오. 4.0 M/초에서 30초 동안 티슈 균질화를 사용하여 파리를 균질화합니다.
- 또는 비드를 생략하고 손으로 플라스틱 유봉이있는 미세 원심 분리기 튜브에서 1 분 동안 균질화하십시오.
- 장내 미생물을 정량화하면 표면이 파리를 살균하여 외인성 미생물을 제거합니다. 1분 동안 100 μl 70% 에탄올이 들어 있는 마이크로센심분리기 튜브로 이송하고, 에탄올을 흡입하고, 균질화를 위해 새로운 미세센트심분리기로 이송한다. 장의 DNA 함량이 측정되면 에탄올 세척 전에 0.6 % 나트륨 hypochlorite로 1 분 동안 헹구는다.
- 875 μl mMRS, 5 초 동안 소용돌이, 마이크로 티터 플레이트의 첫 번째 우물에 균주 120 μl로 균동질을 희석시하십시오.
- 다음 두 우물에서 10 μl 균주 및 70 μl MRS를 사용하여 두 개의 순차적 1:8 희석을 수행합니다.
- 첫 번째 우물에서 10 μl을 제거하고 70 μl MRS를 포함하는 두 번째 우물에 추가하고 두 번째 의 내용을 잘 혼합하고, 70 μl MRS를 포함하는 세 번째 우물에서 두 번째 우물에서 10 μl을 옮기고 철저히 혼합합니다. 이것은 원래 1,000 μl 균주형의 3 개의 총 농도로 이어집니다 : 희석되지 않은, 1:8 및 1:64.
- 각 희석의 10 μl을 mMRS 플레이트로 옮김합니다(원하는 경우 다중 채널 파이펫 사용). 접시를 약간 기울어 희석제를 한천 표면 아래로 몇 밀리미터 아래로 퍼지고 접시를 움직이기 전에 액체가 건조할 수 있습니다. 플레이트가 2일 된 경우 액체가 플레이트에 빠르게 건조되어 두 개의 인접한 물방울의 혼합이 줄어듭니다.
- 1-2 일 동안 30 °C에서 배양하십시오. 한 번 구별, 개별 식민지가 볼 수 있습니다 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 10-100 고립 된 식민지희석에서 계산합니다.
- 비행당 E = C = C x D/P x V/F, 비행당 E= CFU, C= 카운트된 콜로니 수, D = 희석, P = μl 도금, V = 플라이 모모게네이트 부피 및 F = 균질화된 플라이 수를 사용하여 플라이당 CFU를 계산합니다.
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Representative Results
추가 코드 파일: 샘플 계산. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | |
Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | |
Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | |
Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | |
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | |
Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | |
Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | |
Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | |
Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | |
Plastic Bushing | Home Depot | 100404002 | |
Plastic Bushing Cap | Home Depot | 100153897 | |
Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | |
Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | |
Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | |
Filter Pipette Tips, 300 µl | USA Scientific | 1120-9810 | |
Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | |
Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | |
Paintbrush | Walmart | 5133 | |
Forceps | Fisher | 08-882 | |
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | |
Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | |
Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | |
Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | |
Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | |
MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | |
96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | |
1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Filter Pipette Tips, 1,000 µl | USA Scientific | 1122-1830 | |
96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | |
Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | |
Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | |
Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 |