Counting Colony Forming Units (CFU): Quantificazione dei batteri dai corpi di mosca

Overview

Drosophila microbiota influisce sullo sviluppo, l'immunità e la fisiologia dell'animale. Questo video descrive un metodo per quantificare i batteri dalle mosche determinando le unità di formazione della colonia da preparati per tutto il corpo. Il protocollo in primo piano dimostra la tecnica con le mosche, allevate in condizioni gnotobiotiche utilizzando quattro specie batteriche.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Koyle et al., Allevamento della Mosca della Frutta Drosophila melanogaster Sotto condizioni axeniche e gnotobiotiche, J. Vis. Exp. (2016).

1. Dechorionate Uova e Trasferimento a Dieta Sterile

1. Preparare l'armadio per la biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con il 70% di etanolo. Pulire il fondo con un tessuto da laboratorio e sterilizzare il cappuccio con luce UV per ~ 15 minuti. Sterilizzare tutte le forniture non biologiche (tazze campione, pennello, forcep, contenitore di rifiuti, acqua sterilizzata da 400 ml e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%) spruzzando con etanolo e mettendo immediatamente nell'armadio della biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 minuti.
2. Inizia il primo di 2 lavaggi di ipoclorito di sodio posizionando la boccola con le uova in una tazza di campioni da 120 ml o in un altro contenitore sterile. Versare lentamente ~ 90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
3. Risciacquare le uova per 2,5 minuti. Sospendere periodicamente le uova utilizzando le forcette per spostare la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
4. Trasferire la boccola direttamente in una tazza di secondo campione, preriempì con candeggina da 90 ml, all'interno dell'armadio per la biosicurezza.
5. Ripetere il passaggio 1.3 all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Alla fine del secondo trattamento di candeggina, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
6. Eseguire i passaggi 1.7-1.8 nell'armadio per la biosicurezza.
7. Scartare la candeggina e lavare la boccola con acqua sterile 3 volte. Sospendere le uova più volte durante ogni lavaggio spostando la boccola con le forcep. Entro la fine del terzo lavaggio la maggior parte delle uova dovrebbe essere attaccata al lato della boccola.
8. Utilizzando un pennello sterilizzato in etanolo, trasferire le uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Puntare a 30-50 uova per flaconcino. Lasciare i tappi allentati per consentire all'ossigeno di entrare nel tubo. Se le fiale devono rimanere axeniche, trasferire in un'incubatrice di insetti; in caso contrario, aggiungere batteri come di seguito.

2. Fai mosche gnotobiotiche usando 4 specie batteriche

1. Preparare i batteri
   1. Preparare un armadio di biosicurezza sterilizzato con le forniture necessarie (pipette, scatole di punta di pipetta, tubi di centrifuga sterilizzati, brodo MRS e rack per provette) come nel passaggio 1.1. Pulire l'esterno delle provette con una salvietta da laboratorio imbevuta di etanolo prima di posizionare in un armadio per la biosicurezza.
   2. Pellettò i batteri trasferendo prima 500 μl di crescita notturna in un tubo di microfugo sterile. Se la densità batterica è bassa, aggiungere fino a 1,5 ml a ciascun tubo o rimuovere in sequenza il supernatante e aggiungere coltura extra allo stesso tubo. Rimuovere i campioni dall'armadio di biosicurezza e centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g. Utilizzare le punte del filtro per evitare la contaminazione tra campioni.
   3. Determinare la densità di ogni coltura misurando OD₆₀₀. Se si utilizza un lettore di piastre multi-pozzo, trasferire 200 μl di ogni coltura in una piastra da 96 po 'in diluizioni da 1, 2 e 4 volte.
   4. Determinare la quantità di mMRS in cui diluire ogni pellet di cella (2.1.2) utilizzando uno spettrofotometro di lettura della piastra e le seguenti equazioni. Pianifica di aggiungere abbastanza brodo da inoculare 50 μl a ogni fiala di mosca.
      1. Raccogli le_{letture OD 600} per una diluizione 1:1, 1:2 e 1:4 di ogni coltura batterica su uno spettrofotometro a lettura di lastre. Selezionare la diluizione per ogni ceppo batterico che produce un valore OD₆₀₀ compreso tra 0,1 e 0,2 e utilizzare questo valore e il corrispondente fattore di diluizione come "O" e "D" nelle formule fornite ai punti 2.1.4.2 o 2.1.4.3.
      2. Se si utilizzano le 4 specie qui descritte, normalizzare le cellule con densità equivalenti di formazione di colonie (CFU)/ml (conversione da OD₆₀₀ a CFU determinata in precedenza in Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) usando questa equazione:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         dove E = volume per resopendire il pellet in (μl), O = batteri OD_600, B = OD₆₀₀ mezzi vuoti, D = diluizione piegata, V = μl coltura batterica prima della centrifugazione, C = OD₆₀₀ di costante predeterminata. Per esempi di calcoli che utilizzano queste equazioni, vedere File di codice supplementare. Per gli spettrofotometri che si sbozzino automaticamente, utilizzare "O" al posto di "O-B".
         NOTA: Le costanti predeterminate (unità OD_600,normalizzate a 10⁷ CFU ml^-1,costanti derivate in Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)sono i seguenti: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Se si utilizzano altre specie batteriche (non è disponibile alcuna costante CFU/OD_600), normalizzare la densità in OD₆₀₀ = 0,1 usando questa equazione:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         NOTA: Le unità sono le stesse del passaggio 2.1.4.2. Per esempi di calcoli che utilizzano queste equazioni, vedere File di codice supplementare.
   5. Nell'armadio di biosicurezza, rimuovere il supernatante con una punta di pipetta e rimescolare il pellet in mMRS o PBS freschi come calcolato nel passaggio 2.1.4.2.
2. Inoculare i batteri
   1. Trasferire 50 μl dei batteri nei tubi conici con dieta sterile e uova dechorionated in armadietto di biosicurezza. Aggiungere batteri dopo il trasferimento delle uova per prevenire la contaminazione tra fiale.
   2. Posizionare tubi inoculati in un'incubatrice a 25 °C.

3. Misurare il carico/test CFU per la sterilità

1. Per misurare il carico di CFU in omogenei di mosca per tutto il corpo, trasferire 5 mosche (5-7 giorni dopo l'esclusione) in un tubo di microfugo da 1,7 ml contenente 125 μl di perline ceramiche e 125 μl di brodo mMRS. Omogeneizzare le mosche usando un omogeneizzatore tissutale per 30 secondi a 4,0 M/sec.
   1. In alternativa, omettere perline e omogeneizzare a mano in tubi di microcentrifugo con pestelli di plastica per 1 minuto.
   2. Se si quantifica il microbiota intestinale, sterilizzare in superficie le mosche per rimuovere i microbi esogeni. Trasferire le mosche su un tubo di microcentrifugo contenente 100 μl 70% di etanolo per 1 min, aspirare l'etanolo e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifugo per omogeneizzazioni. Se verrà misurato il contenuto di DNA dell'intestino, sciacquare per 1 minuto con ipoclorito di sodio allo 0,6% prima del lavaggio dell'etanolo.
2. Diluire l'omogeneato con 875 μl mMRS, vortice per 5 sec e pipettare 120 μl di omogeneato nel primo pozzo di una piastra di microtitolo.
3. Eseguire due diluizioni sequenziali 1:8 usando 10 μl omogeneato e 70 μl MRS nei due pozzi successivi.
   1. Rimuovere 10 μl dal primo pozzo e aggiungerlo al secondo pozzo contenente 70 μl MRS. Mescolare accuratamente il contenuto del secondo pozzo, trasferire 10 μl dal secondo pozzo al terzo pozzo contenente 70 μl MRS e mescolare accuratamente. Questo porta a 3 concentrazioni totali dell'omogeneato originale di 1.000 μl: non diluito, 1:8 e 1:64.
4. Trasferire 10 μl di ogni diluizione su una piastra mMRS (utilizzando una pipetta multicanale se lo si desidera). Inclinare leggermente il piatto per stendere la diluizione di diversi millimetri lungo la superficie dell'agar e lasciare asciugare il liquido prima di spostare la piastra. Il liquido si asciuga rapidamente sul piatto se le piastre hanno 2 giorni, riducendo la miscelazione di due goccioline vicine.
5. Incubare a 30 °C per 1-2 giorni. Rimuovere le placche dall'incubatore una volta distinte, le singole colonie sono visibili e contare da una diluizione con 10-100 colonie isolate.
6. Calcolare CFU per mosca usando l'equazione E = C x D/P x V/F, dove E = CFU per mosca, C = numero di colonie contate, D = diluizione, P = μl placcate, V = volume di omogenato di mosca, e F = numero di mosche omogeneizzate.

Representative Results

File di codice supplementare: calcoli di esempio. Clicca qui per visualizzare questo file (fai clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395