ספירת יחידות יוצרות מושבה (CFUs): כימות חיידקים מגופים מעופפים

Overview

מיקרוביוטה Drosophila משפיע על התפתחות החיה, חסינות ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר שיטה לכמת חיידקים מזבובים על ידי קביעת המושבה היוצרת יחידות מהכנות לכל הגוף. הפרוטוקול המוצג מדגים את הטכניקה עם זבובים, שגודלו בתנאים gnotobiotic באמצעות ארבעה מינים חיידקיים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך קויל ואח ',גידול זבוב הפירות Drosophila melanogaster תחת תנאים אקסניק ו Gnotobiotic, J. Vis. Exp. (2016).

1. ביצים Dechorionate ולהעביר דיאטה סטרילית

1. מכינים את ארון ההסמכה הביולוגית על ידי ריסוס החלק הפנימי (כולל צדדים) עם 70% אתנול. לנגב את התחתית עם רקמת מעבדה, לעקר את מכסה המנוע עם אור UV במשך ~ 15 דקות. לעקר את כל האספקה הלא ביולוגית (כוסות דגימה, מברשת צבע, מלקחיים, מיכל פסולת, 400 מ"ל מים מעוקרים, ו 100 מ"ל של 0.6% hypochlorite נתרן) על ידי ריסוס עם אתנול ומיד הצבת בארון biosafety. לעקר עם אור UV במשך 15 דקות.
2. התחל את הראשון של 2 נתרן hypochlorite שוטף על ידי הצבת תותבים עם הביצים לתוך דגימה 120 מל או מיכל סטרילי אחר. יוצקים לאט ~ 90 מ"ל של 0.6% פתרון hypochlorite נתרן לתוך תותב עד ממש מתחת לשפה.
3. שוטפים ביצים במשך 2.5 דקות. מעת לעת להשעות מחדש את הביצים באמצעות מלקחיים כדי להזיז את תותב למעלה ולמטה בתמיסה hypochlorite.
4. מעבירים את התותב ישירות לתוך דגימה שנייה, מלא מראש עם אקונומיקה 90 מל, בתוך ארון biosafety.
5. חזור על שלב 1.3 בתוך ארון ההסתעף הביולוגי. בסוף הטיפול השני אקונומיקה, הביצים צריך להתחיל לדבוק בצדדים של תותב.
6. בצעו את שלבים 1.7-1.8 בארון הביו-רוויה.
7. להשליך את האקונומיקה ולשטוף את התותב עם מים סטריליים 3 פעמים. להשעות מחדש את הביצים מספר פעמים במהלך כל כביסה על ידי הזזת תותב עם מלקחיים. עד סוף השלישי לשטוף את רוב הביצים צריך להיות מחובר לצד של תותב.
8. באמצעות מכחול מעוקר באתנול, להעביר ביצים מצד התועבה לתנונה סטרילית. מעבירים ביצים בנפרד או בקבוצות קטנות. לכוון 30-50 ביצים לכל בקבוקון. השאירו את הכובעים רופפים כדי לאפשר לחמצן להיכנס לצינור. אם בקבוקונים הם להישאר גרזן, להעביר לאינקובטור חרקים; אחרת, להוסיף חיידקים כמטה.

2. הפוך זבובים gnotobiotic באמצעות 4 מינים חיידקיים

1. הכנת חיידקים
   1. הכינו ארון biosafety מעוקר עם אספקה הכרחית (פיפטות, קופסאות קצה פיפטה, צינורות צנטריפוגה מעוקרים, מרק MRS, ומתלי מבחנה) כמו בשלב 1.1. יש לנגב את החלק החיצוני של המבחנות באמצעות מגבון מעבדה ספוג אתנול לפני הנחת ארון biosafety.
   2. גלולה החיידקים על ידי העברה ראשונה 500 μl של צמיחה לילה צינור microfuge סטרילי. אם צפיפות החיידקים נמוכה, הוסיפו עד 1.5 מ"ל לכל צינור או הסירו ברצף נוזל על-טבעי והוסיפו תרבות נוספת לאותו צינור. הסר דגימות מהארון biosafety וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 x g. השתמש טיפים מסנן כדי למנוע זיהום בין דגימות.
   3. קבע את הצפיפות של כל תרבות על-ידי מדידת OD₆₀₀. אם אתם משתמשים בקורא צלחות רב-באר, העבירו 200 מיקרומטר מכל תרבות לצלחת של 96 באר בדילול של 1, 2 ו-4.
   4. לקבוע את כמות mMRS שבו לדלל כל גלולה תא (2.1.2) באמצעות ספקטרופוטומטר קריאת צלחת ואת המשוואות הבאות. תכנן להוסיף מספיק מרק כדי לחסן 50 μl לכל בקבוקון זבוב.
      1. לאסוף OD₆₀₀ קריאות עבור 1:1, 1:2, ו 1:4 דילול של כל תרבות חיידקית על ספקטרופוטומטר קריאת צלחת. בחר את הדילול עבור כל זן חיידקי המייצר ערך OD₆₀₀ בין 0.1 ל- 0.2 והשתמש בערך זה ובגורם הדילול המתאים לו כ- 'O' ו- 'D' בנוסחאות שניתנו ב- 2.1.4.2 או 2.1.4.3.
      2. אם אתה משתמש ב-4 המינים המתוארים כאן, נרמל תאים ליחידה שווה ערך להרכבת מושבה (CFU) /ml (OD₆₀₀ להמרת CFU שנקבעה בעבר בניואל ודאגלס, Appl Environ Microbiol. (2014)) באמצעות משוואה זו:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         כאשר E = נפח כדי resuspend גלולה ב (μl), O = OD_{600 חיידקים,} B = OD₆₀₀ מדיה ריקה, D = קיפול דילול, V = תרבות חיידקית μl לפני צנטריפוגה, C = OD₆₀₀ של קבוע קבוע מראש. ראה קובץ קוד משלים לקבלת דוגמאות לחישובים באמצעות משוואות אלה. עבור ספקטרופוטומטרים שמתרוקנים באופן אוטומטי, השתמש ב- "O" במקום "O-B".
         שים לב: הקבועים שנקבעו מראש (יחידות OD₆₀₀, מנורמל ל 10⁷ CFU מיליליטר^-1, קבועים נגזר ניואל דאגלס, Appl Environ Microbiol. (2014)הם כדלקמן: א. טרופיס (0.052), א. פומורום (0.038), ל. ברוויס (0.056), ל. פלנטרום (0.077).
      3. אם נעשה שימוש במינים חיידקיים אחרים (אין קבוע CFU/OD₆₀₀ זמין), נרמל את הצפיפות ל- OD₆₀₀ = 0.1 באמצעות משוואה זו:
         E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD₆₀₀
         שים לב: היחידות זהות לשלב 2.1.4.2. ראה קובץ קוד משלים לקבלת דוגמאות לחישובים באמצעות משוואות אלה.
   5. בארון biosafety, להסיר supernatant עם קצה צינור ו resuspend גלולה mMRS טרי או PBS כפי שחושב בשלב 2.1.4.2.
2. חיידקים מחוסנים
   1. להעביר 50 μl של החיידקים לצינורות חרוט עם דיאטה סטרילית וביצים dechorionated בארון biosafety. הוסף חיידקים לאחר העברת ביצה כדי למנוע זיהום בין בקבוקונים.
   2. מניחים צינורות מחוסנים באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס.

3. למדוד עומס CFU / בדיקה עבור עקרות

1. כדי למדוד את עומס CFU בגוף שלם לטוס הומוגנטים, להעביר 5 זבובים (5-7 ימים לאחר eclosion) לצינור מיקרופוגה 1.7 מ"ל המכיל 125 μl של חרוזי קרמיקה ו 125 μl של מרק mMRS. הומוגניזציה זבובים באמצעות הומוגניזר רקמה במשך 30 שניות ב 4.0 M / sec.
   1. לחלופין, להשמיט חרוזים יד הומוגנית בצינורות microcentrifuge עם עלי פלסטיק במשך 1 דקות.
   2. אם מכמתים את המיקרוביוטה של המעיים, פני השטח מעקרים את הזבובים כדי להסיר מיקרואורגניזמים אקסוגניים. העבר זבובים לצינור microcentrifuge המכיל 100 μl 70% אתנול במשך 1 דקות, לשאוף אתנול, ולהעביר צינור microcentrifuge חדש עבור הומוגניזציה. אם תוכן ה- DNA של המעיים יימדד, יש לשטוף במשך דקה עם 0.6% היפוכלוריט נתרן לפני שטיפת האתנול.
2. לדלל את הומוגנט עם 875 μl mMRS, מערבולת במשך 5 שניות, ו pipet 120 μl של הומוגנט לתוך הבאר הראשונה של צלחת microtiter.
3. בצע שני דילולים רציפים 1:8 באמצעות 10 μl הומוגנט ו 70 μl MRS בשתי הבארות.
   1. הסר 10 μl מהבאר הראשונה ולהוסיף אותו לבאר השנייה המכילה 70 μl MRS. לערבב את התוכן של הבאר השנייה ביסודיות, להעביר 10 μl מהבאר השנייה לבאר השלישית המכילה 70 μl MRS, ומערבבים ביסודיות. זה מוביל 3 ריכוזים הכולל של 1,000 μl הומוגנט המקורי: לא מדולל, 1:8, ו 1:64.
4. העבר 10 μl של כל דילול ללוח mMRS (באמצעות צינור רב ערוצי אם תרצה). מעט שיפוע את המנה כדי להפיץ את הדילול כמה מילימטרים על פני השטח אגר ולאפשר נוזל להתייבש לפני הזזת הצלחת. הנוזל מתייבש על הצלחת במהירות אם הצלחות בנות יומיים, מה שמפחית את הערבוב של שתי טיפות שכנות.
5. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים. מוציאים צלחות מהחממה ברגע שהם נפרדים, מושבות בודדות נראות לעין, וסופרות מדילול עם 10-100 מושבות מבודדות.
6. חשב CFU לכל זבוב באמצעות המשוואה E = C x D/P x V/F, כאשר E = CFU לכל זבוב, C = מספר המושבות שנספרו, D = דילול, P = מצופה μl, V = נפח של הומוגנט זבוב, ו- F = מספר זבובים הומוגניים.

Representative Results

קובץ קוד משלים: חישובים לדוגמה. נא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395