Unidades formadoras de colonias de conteo (CFU): Cuantificación de bacterias de cuerpos voladores

Overview

La microbiota de Drosophila afecta el desarrollo, la inmunidad y la fisiología del animal. Este video describe un método para cuantificar las bacterias de las moscas mediante la determinación de la colonia formando unidades de preparaciones de todo el cuerpo. El protocolo destacado demuestra la técnica con moscas, criadas en condiciones gnotobióticas utilizando cuatro especies bacterianas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Desconorionar los huevos y transferirlos a la dieta estéril

1. Prepare el gabinete de bioseguridad rociando el interior (incluidos los lados) con un 70% de etanol. Limpie la parte inferior con un tejido de laboratorio y esterilizar la capucha con luz UV durante ~15 min. Esterilizar todos los suministros no biológicos (tazas de muestras, pincel, fórceps, contenedor de residuos, 400 ml de agua esterilizada y 100 ml de hipoclorito sódico al rociar con etanol e inmediatamente colocar en el armario de bioseguridad. Esterilizar con luz UV durante 15 min.
2. Comience el primero de 2 lavados de hipoclorito de sodio colocando el casquillo con los huevos en una taza de muestra de 120 ml u otro recipiente estéril. Vierta lentamente ~90 ml de solución hipoclorita sódica al 0,6% hasta que esté justo debajo de la llanta.
3. Enjuague los huevos durante 2,5 minutos. Re-suspender periódicamente los huevos mediante el uso de fórceps para mover el casquillo hacia arriba y hacia abajo en la solución de hipoclorito.
4. Transfiera el casquillo directamente a una segunda taza de espécimen, precargada con lejía de 90 ml, dentro del armario de bioseguridad.
5. Repita el paso 1.3 dentro del armario de bioseguridad. Al final del segundo tratamiento con lejía, los huevos deben comenzar a adherirse a los lados del buje.
6. Realice los pasos 1.7-1.8 en el gabinete de bioseguridad.
7. Deseche la lejía y lave el casquillo con agua estéril 3 veces. Vuelva a suspender los huevos varias veces durante cada lavado moviendo el casquillo con fórceps. Al final del tercer lavado, la mayoría de los huevos deben estar unidos al lado del buje.
8. Usando un pincel esterilizado en etanol, transfiera los huevos del lado del buje a la dieta estéril. Transfiera los huevos individualmente o en lotes pequeños. Aspirar a 30-50 huevos por vial. Deje las tapas sueltas para permitir que el oxígeno entre en el tubo. Si los viales deben permanecer a hacha, transfiéralo a una incubadora de insectos; de lo contrario, añadir bacterias como se muestra a continuación.

2. Hacer moscas gnotobióticas usando 4 especies bacterianas

1. Preparar bacterias
   1. Prepare un gabinete de bioseguridad esterilizado con los suministros necesarios (pipetas, cajas de puntas de pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS y bastidores de tubos de ensayo) como en el paso 1.1. Limpie el exterior de los tubos de ensayo con una toallita de laboratorio empapada en etanol antes de colocarla en el armario de bioseguridad.
   2. Peletizar la bacteria transfiriendo primero 500 μl de crecimiento nocturno a un tubo de microfugio estéril. Si la densidad bacteriana es baja, añadir hasta 1,5 ml a cada tubo o eliminar secuencialmente el sobrenadante y añadir cultivo adicional al mismo tubo. Retire las muestras del gabinete de bioseguridad y la centrífuga durante 10 minutos a 10.000 x g. Utilice puntas de filtro para evitar la contaminación entre muestras.
   3. Determinar la densidad de cada cultivo midiendo OD₆₀₀. Si utiliza un lector de placas multi-pozo, transfiera 200 μl de cada cultivo a una placa de 96 pozos en diluciones de 1, 2 y 4 veces.
   4. Determine la cantidad de mMRS en la que diluir cada pellet de celda (2.1.2) utilizando un espectrofotómetro de lectura de placas y las siguientes ecuaciones. Planee agregar suficiente caldo para inocular 50 μl a cada vial de mosca.
      1. Recoge lecturas de OD₆₀₀ para una dilución de 1:1, 1:2 y 1:4 de cada cultivo bacteriano en un espectrofotómetro de lectura de placas. Seleccione la dilución para cada cepa bacteriana que produzca un valor OD₆₀₀ entre 0,1 y 0,2 y utilice este valor y su correspondiente factor de dilución como 'O' y 'D' en las fórmulas indicadas en 2.1.4.2 o 2.1.4.3.
      2. Si utiliza las 4 especies descritas aquí, normalice las células a densidades equivalentes de la unidad de formación de colonias (CFU)/ml (OD₆₀₀ a CFU determinadas anteriormente en Newell y Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) utilizando esta ecuación:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         donde E = volumen a pellet resuspend en (μl), O = bacterias OD_600, B = OD₆₀₀ medios en blanco, D = dilución plegable, V = cultivo bacteriano μl antes de la centrifugación, C = OD₆₀₀ de constante predeterminada. Consulte Archivo de código suplementario para ver ejemplos de cálculos utilizando estas ecuaciones. Para espectrofotómetros que se en blanco automáticamente, utilice "O" en lugar de "O-B".
         NOTA: Las constantes predeterminadas (unidades OD_600,normalizadas a 10⁷ CFU ml^-1,constantes derivadas en Newell y Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) son los siguientes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Si se utilizan otras especies bacterianas (no hay ninguna constante CFU/OD₆₀₀ disponible), normalice la densidad a OD₆₀₀ = 0.1 utilizando esta ecuación:
         E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD₆₀₀
         NOTA: Las unidades son las mismas que en el paso 2.1.4.2. Consulte Archivo de código suplementario para ver ejemplos de cálculos utilizando estas ecuaciones.
   5. En el armario de bioseguridad, retire el sobrenadante con una punta de pipeta y resuspend el pellet en mMRS fresco o PBS según lo calculado en el paso 2.1.4.2.
2. Inocular bacterias
   1. Transfiera 50 μl de la bacteria a los tubos cónicos con dieta estéril y huevos desoconserados en gabinete de bioseguridad. Agregue bacterias después de la transferencia de óvulos para evitar la contaminación entre viales.
   2. Coloque tubos inoculados en una incubadora a 25 °C.

3. Mida la carga/prueba CFU para la esterilidad

1. Para medir la carga CFU en homogeneatos de moscas enteras del cuerpo, transfiera 5 moscas (5-7 días después de la eclosión) a un tubo de microcombustible de 1,7 ml que contenga 125 μl de cuentas cerámicas y 125 μl de caldo mMRS. Homogeneizar moscas usando un homogeneizador de tejido durante 30 s a 4.0 M/seg.
   1. Alternativamente, omita las cuentas y homogeneice a mano en tubos de microcentrífuga con pestles de plástico durante 1 min.
   2. Si cuantifica la microbiota intestinal, la superficie esteriliza las moscas para eliminar microbios exógenos. Transfiera las moscas a un tubo de microcentrífuga que contenga 100 μl 70% de etanol durante 1 min, a aspirete etanol y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga para homogeneizaciones. Si se medirá el contenido de ADN del intestino, enjuague durante 1 min con un hipoclorito de sodio del 0,6% antes del lavado de etanol.
2. Diluir el homogeneato con 875 μl mMRS, vórtice durante 5 s, y pipete 120 μl de homogeneato en el primer pozo de una placa de microtitro.
3. Realice dos diluciones secuenciales de 1:8 utilizando 10 μl de homogeneato y 70 μl de MRS en los dos siguientes pozos.
   1. Retire 10 μl del primer pozo y agréguelo al segundo pozo que contenga 70 μl MRS. Mezcle el contenido del segundo pozo a fondo, transfiera 10 μl del segundo pozo al tercer pozo que contenga 70 μl de MRS y mezcle bien. Esto conduce a 3 concentraciones totales del homogeneato original de 1.000 μl: sin diluir, 1:8 y 1:64.
4. Transfiera 10 μl de cada dilución a una placa mMRS (utilizando un pipete multicanal si lo desea). Incline ligeramente el plato para extender la dilución varios milímetros por la superficie del agar y permitir que el líquido se seque antes de mover la placa. El líquido se seca en la placa rápidamente si las placas tienen 2 días de antigüedad, reduciendo la mezcla de dos gotas vecinas.
5. Incubar a 30 °C durante 1-2 días. Retire las placas de la incubadora una vez distintas, las colonias individuales son visibles, y cuenten de una dilución con 10-100 colonias aisladas.
6. Calcular CFU por mosca utilizando la ecuación E = C x D/P x V/F, donde E = CFU por mosca, C = número de colonias contadas, D = dilución, P = μl chapado, V = volumen de homogeneizado de mosca, y F = número de moscas homogeneizadas.

Representative Results

Archivo de código suplementario: Cálculos de muestra. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395