Tælle koloniformningsenheder (CFU'er): Kvantificere bakterier fra flyvelegemer

Overview

Drosophila mikrobiota påvirker dyrets udvikling, immunitet og fysiologi. Denne video beskriver en metode til at kvantificere bakterier fra fluer ved at bestemme kolonien danner enheder fra hele kroppen præparater. Den fremhævede protokol demonstrerer teknikken med fluer, opdrættet under gnotobiotiske forhold ved hjælp af fire bakteriearter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Koyle et al.,Opdræt af Frugt Fly Drosophila melanogaster Under Axenic og Gnotobiotic Betingelser, J. Vis. Exp. (2016).

1. Dechorionate Æg og overførsel til steril kost

1. Forbered biosikkerhedsskabet ved at sprøjte indersiden (inklusive sider) med 70% ethanol. Tør bunden med et laboratorievæv, og steriliser emhætten med UV-lys i ~ 15 min. Alle ikke-biologiske forsyninger steriliseres (prøvekopper, pensel, pincet, affaldsbeholder, 400 ml steriliseret vand og 100 ml 0,6% natriumhypochlorit) ved sprøjtning med ethanol og straks anbringelse i biosikkerhedsskabet. Steriliser med UV-lys i 15 minutter.
2. Start den første af 2 natriumhypochlorit vasker ved at placere bøsningen med æggene i en 120 ml prøvekop eller anden steril beholder. Hæld langsomt ~ 90 ml 0,6% natriumhypochloritopløsning i bøsningen indtil lige under kanten.
3. Skyl æg i 2,5 min. Regelmæssigt suspendere æggene igen ved hjælp af pincet til at flytte bøsningen op og ned i hypochloritopløsningen.
4. Bøsningen overføres direkte til en anden prøvekop, forfyldt med 90 ml blegemiddel, inde i biosikkerhedsskabet.
5. Gentag trin 1.3 inde i biosikkerhedsskabet. I slutningen af den anden blegemiddelbehandling skal æggene begynde at klæbe til siderne af bøsningen.
6. Udfør trin 1.7-1.8 i biosikkerhedsskabet.
7. Kassér blegemidlet og vask bøsningen med sterilt vand 3 gange. Suspendere æggene flere gange under hver vask ved at flytte bøsningen med pincet. Ved udgangen af den tredje vask skal de fleste æg fastgøres til siden af bøsningen.
8. Ved hjælp af en pensel steriliseret i ethanol overføres æg fra siden af bøsningen til den sterile kost. Overfør æg individuelt eller i små partier. Sigt efter 30-50 æg pr. hætteglas. Lad hætterne løsne, så der kommer ilt ind i røret. Hvis hætteglas skal forblive økseagtige, overføres til en insektinkubator; Ellers tilsættes bakterier som nedenfor.

2. Lav gnotobiotiske fluer ved hjælp af 4 bakteriearter

1. Forbered bakterier
   1. Forbered et steriliseret biosikkerhedsskab med nødvendige forsyninger (pipetter, pipettespidskasser, steriliserede centrifugerør, MRS-bouillon og reagensglasreoler) som i trin 1.1. Tør ydersiden af reagensglas med en ethanol-gennemblødt laboratorieservietter, før du placerer i biosikkerhed kabinet.
   2. Pellet bakterierne ved først at overføre 500 μl af natten vækst til en steril mikrofuge rør. Hvis bakterietætheden er lav, tilsættes op til 1,5 ml til hvert rør, eller der fjernes supernatant sekventielt, og der tilsættes ekstra dyrkning til det samme rør. Der udtages prøver fra biosikkerhedsskabet og centrifuge i 10 minutter ved 10.000 x g. Brug filterspidser for at undgå kontaminering mellem prøverne.
   3. Bestem tætheden af hver kultur ved at måle OD₆₀₀. Hvis du bruger en multibrøndspladelæser, overføres 200 μl af hver kultur til en 96-brønds plade i 1-, 2- og 4-foldfortyndinger.
   4. Det bestemmes, hvor meget mMRS hver cellepille (2.1.2) skal fortyndes ved hjælp af et pladeaflæsningsspektrofotometer og følgende ligninger. Planlæg at tilsætte nok bouillon til at vaccinere 50 μl til hvert flueglas.
      1. Indsaml OD_{600-aflæsninger} for et 1:1-, 1:2- og 1:4-fortynding af hver bakteriekultur på et spektrofotometer til pladeaflæsning. Vælg fortyndingen for hver bakteriestamme, der giver en OD_600-værdi mellem 0,1 og 0,2, og brug denne værdi og dens tilsvarende fortyndingsfaktor som 'O' og 'D' i formlerne i 2.1.4.2 eller 2.1.4.3.
      2. Hvis du bruger de 4 arter, der er beskrevet her, normalisere celler til tilsvarende koloni danner enhed (CFU) / ml tætheder (OD₆₀₀ til CFU konvertering bestemmes tidligere i Newell og Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) ved hjælp af denne ligning:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         hvor E = volumen til genbrug af pellet i (μl), O = OD₆₀₀ bakterier, B = OD₆₀₀ blank media, D = foldfortynding, V = μl bakteriekultur før centrifugering, C = OD₆₀₀ af forudbestemt konstant. Se Supplerende kodefil for at få eksempler på beregninger ved hjælp af disse ligninger. For spektrofotometre, der automatisk er tomme, skal du bruge "O" i stedet for "O-B".
         BEMÆRK: De forudbestemte konstanter (enheder OD₆₀₀, normaliseret til 10⁷ CFU ml^-1, konstanter afledt i Newell og Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)er som følger: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Hvis der ved hjælp af andre bakteriearter (ingen CFU/OD₆₀₀ konstant er tilgængelig), normaliseres densiteten til OD₆₀₀ = 0,1 ved hjælp af denne ligning:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         BEMÆRK: Enhederne er de samme som i trin 2.1.4.2. Se Supplerende kodefil for at få eksempler på beregninger ved hjælp af disse ligninger.
   5. I biosikkerhedsskabet fjernes supernatanten med en pipetspids, og pelletlen genbruges i frisk mMRS eller PBS som beregnet i trin 2.1.4.2.
2. Pode bakterier
   1. 50 μl af bakterierne overføres til koniske rør med steril kost og dechorionerede æg i biosikkerhedsskabet. Tilsæt bakterier efter ægoverførsel for at forhindre forurening mellem hætteglas.
   2. Pod podede rør i en inkubator ved 25 °C.

3. Mål CFU-belastning/-test for sterilitet

1. For at måle CFU-belastningen i hele kroppens flyve homogenater overføres 5 fluer (5-7 dage efter eklosion) til et 1,7 ml mikrofugerør, der indeholder 125 μl keramiske perler og 125 μl mMRS bouillon. Homogenisere fluer ved hjælp af en væv homogenisator i 30 sek ved 4,0 M/sek.
   1. Alternativt kan du udelade perler og hånd homogeniseres i mikrocentrifugerør med plastskade i 1 min.
   2. Hvis tarmmikrobiotaen kvantificeres, steriliseres fluerne for at fjerne eksogene mikrober. Der overføres fluer til et mikrocentrifugerør, der indeholder 100 μl 70% ethanol i 1 min., aspiratethanol og overføres til et nyt mikrocentrifugerør til homogeniseringer. Hvis dna-indholdet i tarmen måles, skylles i 1 min. med 0,6% natriumhypochlorit før ethanolvasken.
2. Homogenatet fortyndes med 875 μl mMRS, vortex i 5 sek.
3. Udfør to sekventielle 1:8 fortyndinger med 10 μl homogenat og 70 μl MRS i de næste to brønde.
   1. Fjern 10 μl fra den første brønd og tilsæt den til den anden brønd, der indeholder 70 μl MRS. Bland indholdet af den anden godt grundigt, overfør 10 μl fra den anden brønd til den tredje brønd, der indeholder 70 μl MRS, og bland grundigt. Dette fører til 3 samlede koncentrationer af det oprindelige 1.000 μl homogenat: ufortyndet, 1:8 og 1:64.
4. 10 μl af hver fortynding overføres til en mMRS-plade (eventuelt ved hjælp af en rør med flere kanaler). Hæld skålen lidt for at sprede fortyndingen flere millimeter ned ad agaroverfladen og lad væske tørre, før pladen flyttes. Væsken tørrer hurtigt på pladen, hvis pladerne er 2 dage gamle, hvilket reducerer blandingen af to nærliggende dråber.
5. Inkuber ved 30 °C i 1-2 dage. Fjern plader fra inkubatoren, når de er adskilte, individuelle kolonier er synlige og tæller fra en fortynding med 10-100 isolerede kolonier.
6. Beregn CFU pr. flue ved hjælp af ligningen E = C x D/P x V/F, hvor E = CFU pr. flue, C = antal optalte kolonier, D = fortynding, P = μl belagt, V = rumfang homogenat og F = antal fluer homogeniseret.

Representative Results

Supplerende kodefil: Eksempelberegninger. Klik her for at få vist denne fil (højreklik for at hente den).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395