Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Подсчет единиц формирования колоний (CFUs): Количественная оценка бактерий из мухомохвных тел

Overview

Дрозофила микробиота влияет на развитие животного, иммунитет и физиологию. Это видео описывает метод количественной оценки бактерий от мух, определяя колонии формирования единиц из всего тела препаратов. Рекомендуемый протокол демонстрирует технику с мухами, вырастили в гнотобиотических условиях с использованием четырех бактериальных видов.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Койл и др.,Воспитание плодовой мухи Drosophila меланогастер под Axenic и гнотобиотических условиях, J. Vis. Exp. (2016).

1. Дехорионат яйца и переход на стерильную диету

  1. Подготовка биобезопасности шкаф путем распыления внутри (в том числе стороны) с 70% этанола. Протрите дно лабораторной тканью и стерилизовать капот ультрафиолетовым светом в течение 15 минут. Стерилизовать все не биологические принадлежности (образцы чашки, кисть, типсы, контейнер для отходов, 400 мл стерилизованной воды, и 100 мл 0,6% гипохлорита натрия) путем распыления этанола и сразу же размещения в шкафе биобезопасности. Стерилизовать ультрафиолетовым светом в течение 15 мин.
  2. Начните первый из 2 гипохлорит натрия моет, поместив куст с яйцами в 120 мл образца чашку или другой стерильный контейнер. Медленно вылейте 90 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия в кусты до чуть ниже обода.
  3. Промыть яйца в течение 2,5 мин. Периодически повторно приостанавливать яйца с помощью типсов для перемещения куста вверх и вниз в растворе гипохлорита.
  4. Перенесите куст прямо во вторую чашку образца, предварительно заполненную отбеливателем 90 мл, внутри шкафа биобезопасности.
  5. Повторите шаг 1.3 внутри шкафа биобезопасности. В конце второй обработки отбеливателя, яйца должны начать придерживаться стороны куста.
  6. Выполнить шаги 1.7-1.8 в кабинете биобезопасности.
  7. Откажитесь от отбеливателя и мыть кусты стерильной водой 3 раза. Повторно приостановить яйца несколько раз во время каждой стирки, перемещая кусты с типсами. К концу третьего мытья большинство яиц должны быть прикреплены к стороне куста.
  8. Используя кисть, стерилизованную в этаноле, перенесите яйца со стороны куста на стерильную диету. Передача яиц по отдельности или небольшими партиями. Цель для 30-50 яиц на флакон. Оставьте крышки свободными, чтобы кислород вошел в трубку. Если флаконы остаются топором, перенесите в инкубатор насекомых; в противном случае, добавить бактерии, как ниже.

2. Сделать гнотобиотические мухи с использованием 4 бактериальных видов

  1. Подготовка бактерий
    1. Подготовка стерилизованного шкафа биобезопасности с необходимыми принадлежностями (пипетки, пипетки наконечник коробки, стерилизованные центрифуги трубки, MRS бульон, и пробирки стойки), как в шаге 1.1. Протрите снаружи пробирки с этанолом пропитанной лабораторной салфетки перед размещением в биобезопасности шкаф.
    2. Пеллет бактерий, сначала передавая 500 мкл ночного роста в стерильной трубки микрофуза. Если бактериальная плотность низкая, добавьте до 1,5 мл в каждую трубку или последовательно удалите супернатант и добавьте дополнительную культуру в ту же трубку. Удалите образцы из шкафа биобезопасности и центрифуги в течение 10 минут при 10 000 х г. Используйте советы фильтра, чтобы избежать загрязнения между образцами.
    3. Определите плотность каждой культуры, измерив OD600. При использовании мульти-хорошо пластины читателя, передача 200 йл каждой культуры на 96-хорошо пластины в 1-, 2-, и 4 раза раз раз.
    4. Определите количество mMRS, в котором разбавить каждую ячейку гранулы (2.1.2) с помощью пластины чтения спектрофотометра и следующие уравнения. Планируйте добавить достаточно бульона, чтобы привить 50 мкл к каждому флакону мухи.
      1. Соберите600 показаний OD для 1:1, 1:2 и 1:4 разбавления каждой бактериальной культуры на спектрофотометре для чтения пластин. Выберите разбавление для каждого бактериального штамма, который производит значение OD600 между 0,1 и 0,2 и используйте это значение и соответствующий фактор разбавления как 'O' и 'D' в формулах, данных в 2.1.4.2 или 2.1.4.3.
      2. При использовании 4 видов, описанных здесь, нормализовать клетки эквивалентной единицы формирования колонии (CFU)/ml плотности (OD600 к CFU преобразования определяется ранее в Ньюэлл и Дуглас, Appl Environ Микробиол. (2014)) используя это уравнение:
        E q ((O-B) x V x D)/C
        где E - объем для повторного перерасхода гранул в (ол), O и OD600 бактерий, B и OD600 пустых средств массовой информации, D - разбавления, V и L бактериальной культуры до центрифугации, C и OD600 предопределенной постоянной. Можно привести дополнительный файл кода для примеров вычислений с использованием этих уравнений. Для спектрофотометров, которые автоматически пустые, используйте "O" вместо "O-B".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Предопределенные константы (единицы OD600, нормализовались до 107 CFU мл-1, константы, полученные в Ньюэлл и Дуглас, Appl Environ Микробиол. (2014)) являются следующими: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. При использовании других видов бактерий (не существует константы CFU/OD600), нормализуйте плотность до OD600 и 0.1, используя это уравнение:
        E q ((O-B) x V x D)/0.1 OD600
        ПРИМЕЧАНИЕ: Единицы такие же, как в шаге 2.1.4.2. Можно привести дополнительный файл кода для примеров вычислений с использованием этих уравнений.
    5. В кабинете биобезопасности удалите супернатант кончиком трубы и повторно поместите гранулы в свежие mMRS или PBS, рассчитанные в шаге 2.1.4.2.
  2. Прививаемые бактерии
    1. Перенесите 50 мл бактерий в конические трубки со стерильной диетой и дехорионированными яйцами в кабинете биобезопасности. Добавить бактерии после передачи яйцеклеток, чтобы предотвратить загрязнение между флаконами.
    2. Поместите привитые трубки в инкубатор при 25 градусов по Цельсию.

3. Измерение нагрузки CFU/теста на стерильность

  1. Для измерения нагрузки CFU в целом организме летают гомогенаты, перенесите 5 мух (5-7 дней после еклок) в 1,7 мл микрофузной трубки, содержащей 125 мкл керамических бусинок и 125 мкм бульона мРС. Гомогенизируйте мух с помощью однородного ткани в течение 30 сек при 4,0 М/сек.
    1. Кроме того, опустить бисер и руки гомогенизировать в микроцентрифуг трубки с пластиковыми пестиками в течение 1 мин.
    2. При количественной оценке микробиоты кишечника, поверхность стерилизовать мух для удаления экзогенных микробов. Передача мух в микроцентрифуг трубки, содержащей 100 мкл 70% этанола в течение 1 мин, аспират этанола, и передачи в новую трубку микроцентрифуг для гомогенизации. Если содержание ДНК в кишечнике будет измерено, промыть в течение 1 мин с 0,6% гипохлорита натрия до мытья этанола.
  2. Разбавить гомогенат с 875 мкмРС, вихрь в течение 5 сек, и пипетки 120 мкл гомогената в первую колодец пластины микротитр.
  3. Выполните два последовательных разбавления 1:8, используя 10 мкл гомогената и 70 МКЛ MRS в следующих двух скважинах.
    1. Удалите 10 мкл из первой хорошо и добавить его во второй колодец, содержащий 70 мкл MRS. Смешайте содержимое второй хорошо тщательно, передать 10 мкл от второй хорошо в третий колодец, содержащий 70 х l MRS, и тщательно перемешать. Это приводит к 3 общим концентрациям исходного гомогената 1000 мкл: неразбавленный, 1:8 и 1:64.
  4. Передача 10 мкл каждого разбавления на пластину mMRS (с использованием многоканальной трубы при желании). Слегка наклоняйте блюдо, чтобы разложить разбавление на несколько миллиметров вниз по поверхности агара и дать жидкости высохнуть перед перемещением пластины. В жидкости высыхает на тарелке быстро, если пластины 2 дней, уменьшая смешивание двух соседних капель.
  5. Инкубация при 30 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней. Удалите пластины из инкубатора после того, как различные, отдельные колонии видны, и рассчитывать от разбавления с 10-100 изолированных колоний.
  6. Рассчитайте CFU на муху, используя уравнение E q C x D/P x V/F, где E q CFU на муху, C - количество подсчитанных колоний, D - разбавление, P и L позолочено, V - объем гомогената мухи, и F - количество гомогенизированных мух.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl USA Scientific 1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701
Paintbrush Walmart 5133
Forceps Fisher 08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g
Sodium Acetate VWR 97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch) NA
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl USA Scientific 1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific Model 1395

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Пустое значение выпуск
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter