عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs): تحديد البكتيريا من أجسام الذباب

Overview

تؤثر الميكروبات Drosophila على نمو الحيوان ومناعته وعلم وظائف الأعضاء. يصف هذا الفيديو طريقة لقياس البكتيريا من الذباب من خلال تحديد وحدات تشكيل المستعمرة من استعدادات الجسم كله. ويوضح البروتوكول المميز هذه التقنية مع الذباب، التي تربى في ظل ظروف الكائنات الحية باستخدام أربعة أنواع بكتيرية.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من كويل وآخرون., تربية ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster تحت شروط Axenic والغنوتوبيوتك, J. Vis. Exp. (2016).

1. البيض dechorionate ونقلها إلى النظام الغذائي المعقم

1. إعداد خزانة السلامة البيولوجية عن طريق رش الداخل (بما في ذلك الجانبين) مع الإيثانول 70٪. مسح الجزء السفلي مع نسيج المختبر، وتعقيم غطاء محرك السيارة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية ل ~ 15 دقيقة. تعقيم جميع الإمدادات غير البيولوجية (أكواب العينات ، فرشاة الطلاء ، ملقط ، حاوية النفايات ، 400 مل من الماء المعقم ، و 100 مل من هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪ ) عن طريق الرش بالإيثانول ووضعه على الفور في خزانة السلامة الحيوية. تعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
2. بدء أول من 2 هيبوكلوريت الصوديوم يغسل عن طريق وضع الشجيرات مع البيض في كوب عينة 120 مل أو حاوية معقمة أخرى. صب ببطء ~ 90 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪ في الأدغال حتى أسفل الحافة.
3. شطف البيض لمدة 2.5 دقيقة. دوريا إعادة تعليق البيض باستخدام ملقط لتحريك الشجيرات صعودا وهبوطا في محلول هيبوكلوريت.
4. نقل الأدغال مباشرة إلى كوب عينة الثانية، مليئة مسبقا مع 90 مل التبييض، داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
5. كرر الخطوة 1.3 داخل خزانة السلامة البيولوجية. في نهاية علاج التبييض الثاني ، يجب أن يبدأ البيض في الالتزام بجوانب الأدغال.
6. تنفيذ الخطوات 1.7-1.8 في خزانة السلامة البيولوجية.
7. تجاهل التبييض وغسل الشجيرات بالماء العقيم 3 مرات. إعادة تعليق البيض عدة مرات خلال كل غسل عن طريق تحريك الشجيرات مع ملقط. بحلول نهاية الغسيل الثالث يجب إرفاق معظم البيض إلى جانب الأدغال.
8. باستخدام فرشاة الطلاء المعقمة في الإيثانول، نقل البيض من جانب الأدغال إلى النظام الغذائي العقيم. نقل البيض بشكل فردي أو على دفعات صغيرة. تهدف إلى 30-50 بيضة لكل قارورة. اترك القبعات فضفاضة للسماح للأوكسجين بدخول الأنبوب. إذا كانت القنينات ستبقى محورية ، فانتقل إلى حاضنة الحشرات ؛ خلاف ذلك، إضافة البكتيريا على النحو التالي.

2. جعل الذباب الغنوتوبيوتك باستخدام 4 أنواع بكتيرية

1. إعداد البكتيريا
   1. إعداد خزانة السلامة البيولوجية المعقمة مع الإمدادات اللازمة (ماصة، صناديق تلميح ماصة، أنابيب الطرد المركزي المعقمة، مرق MRS، ورفوف أنبوب الاختبار) كما هو الحال في الخطوة 1.1. امسح الجزء الخارجي من أنابيب الاختبار بمسح مختبري غارق في الإيثانول قبل وضعه في خزانة السلامة الحيوية.
   2. بيليه البكتيريا عن طريق نقل أول 500 ميكرولتر من النمو بين عشية وضحاها إلى أنبوب ميكروفوج عقيمة. إذا كانت الكثافة البكتيرية منخفضة، أضف ما يصل إلى 1.5 مل إلى كل أنبوب أو قم بإزالة النتواز المتتابع وأضف ثقافة إضافية إلى نفس الأنبوب. إزالة عينات من خزانة السلامة الحيوية والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 10،000 x ز. استخدم نصائح التصفية لتجنب التلوث بين العينات.
   3. تحديد كثافة كل ثقافة عن طريق قياس OD₆₀₀. إذا كنت تستخدم قارئ لوحة متعددة الآبار، نقل 200 ميكرولتر من كل ثقافة إلى لوحة 96 جيدا في 1-، 2-، و 4 أضعاف التخفيفات.
   4. تحديد كمية mMRS التي تمييع كل بيليه الخلية (2.1.2) باستخدام مطياف قراءة لوحة والمعادلات التالية. خطة لإضافة ما يكفي من مرق لتطعيم 50 ميكرولتر إلى كل قارورة ذبابة.
      1. جمع قراءات OD₆₀₀ ل1:1، 1:2، و 1:4 تخفيف كل ثقافة بكتيرية على مطياف قراءة لوحة. حدد التخفيف لكل سلالة بكتيرية تنتج قيمة OD₆₀₀ بين 0.1 و 0.2 واستخدم هذه القيمة وعامل التخفيف المقابل لها ك "O" و "D" في الصيغ المعطاة في 2.1.4.2 أو 2.1.4.3.
      2. إذا باستخدام الأنواع 4 الموصوفة هنا، تطبيع الخلايا إلى وحدة تشكيل مستعمرة مكافئة (CFU) / مل كثافات (OD₆₀₀ لتحويل CFU المحددة سابقا في نويل ودوغلاس، أبول Environ Microbiol. (2014)) باستخدام هذه المعادلة:
         E = ((O-B) × V × D)/C
         حيث E = حجم لإعادة الإنفاق بيليه في (ميكرول)، O = OD₆₀₀ البكتيريا، B = OD₆₀₀ وسائل الإعلام فارغة، D = أضعاف المخفف، V = μl الثقافة البكتيرية قبل الطرد المركزي، C = OD₆₀₀ من ثابت محدد سلفا. راجع ملف التعليمات البرمجية التكميلية للحصول على أمثلة من العمليات الحسابية باستخدام هذه المعادلات. بالنسبة لمطيافات الطيف التي تكون فارغة تلقائيا، استخدم "O" بدلا من "O-B".
         ملاحظة: الثوابت المحددة سلفا (وحدات OD₆₀₀، تطبيعها إلى 10⁷ CFU ml^-1، الثوابت المشتقة في Newell و Douglas ، Appl Environ Microbiol. (2014)هي على النحو التالي: A. tropicalis (0.052)، A. pomorum (0.038)، L. brevis (0.056)، L. بلانتاروم (0.077).
      3. في حالة استخدام أنواع بكتيرية أخرى (لا يتوفر ثابت CFU/OD_600)، يمكنك تطبيع الكثافة إلى OD₆₀₀ = 0.1 باستخدام هذه المعادلة:
         E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD₆₀₀
         ملاحظة: الوحدات هي نفسها كما في الخطوة 2.1.4.2. راجع ملف التعليمات البرمجية التكميلية للحصول على أمثلة من العمليات الحسابية باستخدام هذه المعادلات.
   5. في خزانة السلامة الحيوية، قم بإزالة الناموست بطرف ماصة وإعادة إنفاق بيليه في mMRS الطازجة أو PBS كما تم حسابه في الخطوة 2.1.4.2.
2. تلقيح البكتيريا
   1. نقل 50 ميكرولتر من البكتيريا إلى أنابيب مخروطية مع اتباع نظام غذائي معقم والبيض dechorionated في خزانة السلامة الحيوية. إضافة البكتيريا بعد نقل البيض لمنع التلوث بين القنينات.
   2. ضع أنابيب تلقيح في حاضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.

3. قياس CFU تحميل / اختبار للعقم

1. لقياس حمولة CFU في الجسم كله يطير متجانسات، نقل 5 الذباب (5-7 أيام بعد الانفجار) إلى أنبوب ميكروفوج 1.7 مل تحتوي على 125 ميكروغرام من الخرز السيراميك و 125 ميكروغرام من مرق mMRS. تجانس الذباب باستخدام متجانس الأنسجة لمدة 30 ثانية في 4.0 M/sec.
   1. بدلا من ذلك، حذف الخرز واليد تجانس في أنابيب الطرد المركزي الدقيق مع الآفات البلاستيكية لمدة 1 دقيقة.
   2. إذا كان قياس الميكروبات الأمعاء، سطح تعقيم الذباب لإزالة الميكروبات الخارجية. نقل الذباب إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على 100 ميكرولتر 70٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة، أسبيرات الإيثانول، ونقل إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق للتجانس. إذا كان سيتم قياس محتوى الحمض النووي للأمعاء، شطف لمدة 1 دقيقة مع 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم قبل غسل الإيثانول.
2. تمييع المتجانسة مع 875 ميكرولتر mMRS، دوامة لمدة 5 ثوان، وماصة 120 ميكرولتر من المتجانسة في البئر الأول من لوحة microtiter.
3. تنفيذ اثنين من المخففات متتابعة 1:8 باستخدام 10 ميكرولتر متجانسة و 70 ميكرولتر MRS في البئرين المقبلين.
   1. إزالة 10 ميكرولتر من البئر الأول وإضافته إلى البئر الثاني الذي يحتوي على 70 ميكرولتر MRS. مزيج محتويات البئر الثاني جيدا، ونقل 10 ميكرولتر من البئر الثاني إلى البئر الثالثة التي تحتوي على MRS 70 ميكرولتر، وتخلط جيدا. وهذا يؤدي إلى 3 تركيزات إجمالية من التجانس الأصلي 1000 ميكرولتر: غير مخفف، 1:8، و 1:64.
4. نقل 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى لوحة mMRS (باستخدام ماصة متعددة القنوات إذا رغبت في ذلك). يميل قليلا الطبق لنشر تخفيف عدة ملليمترات أسفل سطح أجار والسماح للسائل لتجف قبل تحريك لوحة. يجف السائل على اللوحة بسرعة إذا كانت اللوحات عمرها يومين ، مما يقلل من خلط قطرتين مجاورتين.
5. حضانة في 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. إزالة لوحات من الحاضنة متميزة مرة واحدة، والمستعمرات الفردية مرئية، والعد من تخفيف مع 10-100 مستعمرة معزولة.
6. حساب CFU لكل ذبابة باستخدام المعادلة E = C × D / P x V / F ، حيث E = CFU لكل ذبابة ، C = عدد المستعمرات التي تم عدها ، D = التخفيف ، P = μl مطلي ، V = حجم تجانس الذباب ، و F = عدد الذباب المتجانس.

Representative Results

ملف التعليمات البرمجية التكميلية: عينة الحسابات. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395