Räkna koloniformningsenheter (CFUs): Kvantifiera bakterier från flugkroppar

Overview

Drosophila mikrobiota påverkar djurets utveckling, immunitet och fysiologi. Denna video beskriver en metod för att kvantifiera bakterier från flugor genom att bestämma kolonin som bildar enheter från hela kroppen preparat. Det presenterade protokollet visar tekniken med flugor, uppfödda under gnotobiotiska förhållanden med hjälp av fyra bakteriearter.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Koyle et al., Uppfödning av fruktflugan Drosophila melanogaster Under Axenic och Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Dechorionate ägg och överföring till steril kost

1. Förbered biosäkerhetsskåpet genom att spruta insidan (inklusive sidorna) med 70% etanol. Torka av botten med en labbvävnad och sterilisera huven med UV-ljus i ~15 min. Sterilisera alla icke-biologiska förnödenheter (provkoppar, pensel, tång, avfallsbehållare, 400 ml steriliserat vatten och 100 ml 0,6% natriumhypoklorit) genom att spruta med etanol och omedelbart placera i biosäkerhetsskåpet. Sterilisera med UV-ljus i 15 min.
2. Börja den första av 2 natriumhypoklorittvättar genom att placera bussningen med äggen i en 120 ml provkopp eller annan steril behållare. Häll långsamt ~ 90 ml 0,6% natriumhypokloritlösning i bussningen till strax under kanten.
3. Skölj ägg i 2,5 min. Suspendera regelbundet äggen igen genom att använda tång för att flytta bussningen upp och ner i hypokloritlösningen.
4. Överför bussningen direkt till en andra provkopp, förfylld med 90 ml blekmedel, inuti biosäkerhetsskåpet.
5. Upprepa steg 1.3 inuti biosäkerhetsskåpet. I slutet av den andra blekbehandlingen bör äggen börja klibba sig på sidorna av bussningen.
6. Utför steg 1.7-1.8 i biosäkerhetsskåpet.
7. Kassera blekmedlet och tvätta bussningen med sterilt vatten 3 gånger. Häng äggen flera gånger under varje tvättning genom att flytta bussningen med tång. I slutet av den tredje tvätten bör de flesta ägg fästas på sidan av bussningen.
8. Använd en pensel steriliserad i etanol, överför ägg från sidan av bussningen till den sterila kosten. Överför ägg individuellt eller i små partier. Sikta på 30-50 ägg per flaska. Låt locken vara lösa så att syre kan komma in i röret. Om injektionsflaskan ska förbli yxnisk, överför till en insektsinkubator; annars, tillsätt bakterier enligt nedan.

2. Gör Gnotobiotiska flugor med 4 bakteriearter

1. Förbered bakterier
   1. Förbered ett steriliserat biosäkerhetsskåp med nödvändiga förnödenheter (pipetter, pipettspetslådor, steriliserade centrifugrör, MRS-buljong och provrörsställ) som i steg 1.1. Torka utsidan av provrören med en etanoldränkt laboratorieservett innan du placerar den i biosäkerhetsskåpet.
   2. Pellet bakterierna genom att först överföra 500 μl över natten tillväxt till ett sterilt mikrofugerör. Om bakterietätheten är låg, tillsätt upp till 1,5 ml till varje rör eller ta bort supernatant i tur och botten och tillsätt extra kultur till samma rör. Ta bort prover från biosäkerhetsskåpet och centrifugera i 10 min vid 10 000 x g. Använd filterspetsar för att undvika kontaminering mellan proverna.
   3. Bestäm densiteten för varje kultur genom att mäta OD₆₀₀. Om du använder en multi-well plåtläsare, överför 200 μl av varje kultur till en 96-brunnsplatta i 1-, 2- och 4-faldig utspädningar.
   4. Bestäm hur mycket mMRS som ska spädas ut varje cellpellets (2.1.2) med hjälp av en plåtavläsningsspektrofotometer och följande ekvationer. Planera att lägga till tillräckligt med buljong för att inokulera 50 μl till varje flygflaska.
      1. Samla OD₆₀₀ avläsningar för en 1:1, 1:2 och 1:4 utspädning av varje bakteriekultur på en plåtavläsningsspektrofotometer. Välj utspädning för varje bakteriestam som ger ett OD_600-värde mellan 0,1 och 0,2 och använd detta värde och dess motsvarande utspädningsfaktor som "O" och "D" i de formler som anges i 2.1.4.2 eller 2.1.4.3.
      2. Om du använder de 4 arter som beskrivs här normaliserar du cellerna till motsvarande kolonibildande enhet (CFU)/ml densitet (OD₆₀₀ till CFU-konvertering som tidigare fastställts i Newell och Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) med hjälp av denna ekvation:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         där E = volym till återanvänd pellet i (μl), O = OD₆₀₀ bakterier, B = OD₆₀₀ blinda medier, D = vikspädning, V = μl bakteriekultur före centrifugation, C = OD₆₀₀ av förutbestämd konstant. Se Kompletterande kodfil för exempel på beräkningar med hjälp av dessa ekvationer. För spektrofotometrar som automatiskt är tomma, använd "O" i stället för "O-B".
         OBS: De förutbestämda konstanterna (enheterna OD₆₀₀, normaliserade till 10⁷ CFU ml^-1, konstanter härledda i Newell och Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) är följande: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Om det finns andra bakteriearter (ingen CFU/OD_600-konstant finns tillgänglig), normalisera densiteten till OD₆₀₀ = 0,1 med hjälp av denna ekvation:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         OBS: Enheterna är desamma som i steg 2.1.4.2. Se Kompletterande kodfil för exempel på beräkningar med hjälp av dessa ekvationer.
   5. I biosäkerhetsskåpet, ta bort supernatanten med en rörspets och återanvänd pelleten i färsk mMRS eller PBS enligt steg 2.1.4.2.
2. Inokulera bakterier
   1. Överför 50 μl av bakterierna till de koniska rören med steril kost och dekhorionerade ägg i biosäkerhetsskåpet. Tillsätt bakterier efter äggöverföring för att förhindra kontaminering mellan injektionsflaskan.
   2. Placera inokulerade rör i en inkubator vid 25 °C.

3. Mät CFU-belastning/test för sterilitet

1. För att mäta CFU-belastningen i hela kroppen flyger homogenates, överför 5 flugor (5-7 dagar efter eclosion) till ett 1,7 ml mikrofugerör som innehåller 125 μl keramiska pärlor och 125 μl mMRS-buljong. Homogenisera flugor med hjälp av en vävnadshom homogenisator i 30 sek vid 4,0 M/sek.
   1. Alternativt utelämna pärlor och handhom homogenisera i mikrocentrifugrör med plastskadedjur i 1 min.
   2. Om man kvantifierar tarmfloran steriliserar ytan flugorna för att avlägsna exogena mikrober. Överför flugor till ett mikrocentrifugrör som innehåller 100 μl 70% etanol i 1 min, aspiratetanol och överför till ett nytt mikrocentrifugrör för homogeniseringar. Om tarmens DNA-innehåll mäts, skölj i 1 min med 0,6% natriumhypoklorit före etanoltvätten.
2. Späd homogenatet med 875 μl mMRS, virvel i 5 sekunder och rör 120 μl homogenat i den första brunnen på en mikrotiterplatta.
3. Utför två sekventiella 1:8 utspädningar med 10 μl homogenat och 70 μl MRS i de följande två brunnarna.
   1. Ta bort 10 μl från den första brunnen och tillsätt den till den andra brunnen som innehåller 70 μl MRS. Blanda innehållet i den andra brunnen noggrant, överför 10 μl från den andra brunnen till den tredje brunnen som innehåller 70 μl MRS och blanda noggrant. Detta leder till 3 totala koncentrationer av det ursprungliga homogenatet på 1 000 μl: outspädd, 1:8 och 1:64.
4. Överför 10 μl av varje utspädning till en mMRS-platta (använd ett flerkanaligt rör om så önskas). Luta skålen något för att sprida utspädningen flera millimeter ner i agarytan och låt vätska torka innan du flyttar plattan. Vätskan torkar snabbt på plattan om plattorna är 2 dagar gamla, vilket minskar blandningen av två närliggande droppar.
5. Inkubera vid 30 °C i 1-2 dagar. Ta bort plattor från inkubatorn när de är distinkta, enskilda kolonier är synliga och räknas från en utspädning med 10-100 isolerade kolonier.
6. Beräkna CFU per fluga med hjälp av ekvationen E = C x D/P x V/F, där E = CFU per fluga, C = antal räknade kolonier, D = utspädning, P = μl pläterad, V = volymen flughom homogenat och F = antalet flugor homogeniserat.

Representative Results

Kompletterande kodfil: Exempelberäkningar. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395