Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Telle kolonidannende enheter (CFUer): Kvantifisere bakterier fra fluelegemer

Overview

Drosophila mikrobiota påvirker dyrets utvikling, immunitet og fysiologi. Denne videoen beskriver en metode for å kvantifisere bakterier fra fluer ved å bestemme kolonien som danner enheter fra hele kroppspreparater. Den omtalte protokollen demonstrerer teknikken med fluer, oppdrettet under gnotobiotiske forhold ved hjelp av fire bakterielle arter.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Koyle et al.,Oppdrett av Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic og Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Dechorionate egg og overføring til steril diett

  1. Forbered biosikkerhetsskapet ved å sprøyte innsiden (inkludert sider) med 70% etanol. Tørk bunnen med et laboratorievev, og steriliser hetten med UV-lys i ~ 15 min. Steriliser alle ikke-biologiske forsyninger (prøvekopper, pensel, tang, avfallsbeholder, 400 ml sterilisert vann og 100 ml 0,6% natriumhypokloritt) ved sprøyting med etanol og umiddelbart plassering i biosikkerhetsskapet. Steriliser med UV-lys i 15 min.
  2. Start den første av 2 natriumhypoklorittvasker ved å plassere foringen med eggene i en 120 ml prøvekopp eller annen steril beholder. Hell langsomt ~ 90 ml 0,6% natriumhypoklorittoppløsning i foringen til like under kanten.
  3. Skyll eggene i 2,5 min. Re-suspendere eggene regelmessig ved å bruke tang for å flytte bushing opp og ned i hypoklorittoppløsningen.
  4. Overfør foringen direkte inn i en annen prøvekopp, ferdigfylt med 90 ml blekemiddel, inne i biosikkerhetsskapet.
  5. Gjenta trinn 1.3 inne i biosikkerhetsskapet. På slutten av den andre blekemiddelbehandlingen skal eggene begynne å holde seg til sidene av bushing.
  6. Utfør trinn 1.7-1.8 i biosikkerhetsskapet.
  7. Kast blekemiddelet og vask foringen med sterilt vann 3 ganger. Re-suspendere eggene flere ganger under hver vask ved å flytte bushing med tang. Ved slutten av den tredje vasken skal de fleste egg festes til siden av bushing.
  8. Bruk en pensel sterilisert i etanol, overfør egg fra siden av bushing til det sterile dietten. Overfør egg individuelt eller i små partier. Sikt på 30-50 egg per hetteglass. La hettene være løse slik at oksygen kommer inn i røret. Hvis hetteglass skal forbli akseniske, overfør til en insektinkubator; Ellers legger du til bakterier som nedenfor.

2. Lag gnotobiotiske fluer ved hjelp av 4 bakterielle arter

  1. Forbered bakterier
    1. Forbered et sterilisert biosikkerhetsskap med nødvendige forsyninger (pipetter, pipettespissbokser, steriliserte sentrifugerør, MRS-buljong og reagensrørstativer) som i trinn 1.1. Tørk av utsiden av reagensrørene med en etanol-gjennomvåt laboratorieserviett før du legger i biosikkerhetsskap.
    2. Pellet bakteriene ved først å overføre 500 μl av nattvekst til et sterilt mikrofugerør. Hvis bakteriell tetthet er lav, tilsett opptil 1,5 ml til hvert rør eller fjern sekvensielt supernatant og legg til ekstra kultur til samme rør. Fjern prøver fra biosikkerhetsskapet og sentrifugen i 10 min ved 10.000 x g. Bruk filtertips for å unngå kontaminering mellom prøver.
    3. Bestem tettheten til hver kultur ved å måle OD600. Hvis du bruker en multi-brønn plateleser, overfør 200 μl av hver kultur til en 96-brønns plate i 1-, 2- og 4-fold fortynning.
    4. Bestem mengden mMRS for å fortynne hver cellepellet (2.1.2) ved hjelp av et plateavlesningsspektrofotometer og følgende ligninger. Planlegg å legge til nok kjøttkraft til å inokulere 50 μl til hvert flue hetteglass.
      1. Samle OD600 avlesninger for en 1:1, 1:2, og 1:4 fortynning av hver bakteriekultur på et platelesende spektrofotometer. Velg fortynning for hver bakteriestamme som produserer en OD600-verdi mellom 0,1 og 0,2 og bruk denne verdien og den tilsvarende fortynningsfaktoren som 'O' og 'D' i formlene gitt i 2.1.4.2 eller 2.1.4.3.
      2. Hvis du bruker de 4 artene som er beskrevet her, normaliser celler til tilsvarende kolonidanneringsenhet (CFU)/ml tettheter (OD600 til CFU-konvertering som tidligere er bestemt i Newell og Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) ved hjelp av denne ligningen:
        E = ((O-B) x V x D)/C
        der E = volum til resuspend pellet i (μl), O = OD600 bakterier, B = OD600 blanke medier, D = fold-fortynning, V = μl bakteriekultur før sentrifugering, C = OD600 av forhåndsbestemt konstant. Se Tilleggskodefil hvis du vil se eksempler på beregninger ved hjelp av disse formlene. For spektrofotometere som automatisk blanke, bruk "O" i stedet for "O-B".
        MERK: De forhåndsbestemte konstantene (enheter OD600, normalisert til 107 CFU ml-1, konstanter avledet i Newell og Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) er som følger: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Hvis bruk av andre bakteriearter (ingen CFU /OD600 konstant er tilgjengelig), normaliser tettheten til OD600 = 0,1 ved hjelp av denne ligningen:
        E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
        MERK: Enhetene er de samme som i trinn 2.1.4.2. Se Tilleggskodefil hvis du vil se eksempler på beregninger ved hjelp av disse formlene.
    5. I biosikkerhetsskapet fjerner du supernatanten med en pipetspiss og bruker pelletsen på nytt i fersk mMRS eller PBS som beregnet i trinn 2.1.4.2.
  2. Inokulere bakterier
    1. Overfør 50 μl av bakteriene til de koniske rørene med sterilt kosthold og dechorionated egg i biosikkerhetsskap. Tilsett bakterier etter eggoverføring for å forhindre forurensning mellom hetteglass.
    2. Plasser inokulerte rør i en inkubator ved 25 °C.

3. Mål CFU-belastning/-test for sterilitet

  1. For å måle CFU-belastningen i hele kroppen fly homogenater, overfør 5 fluer (5-7 dager etter eklosjon) til et 1,7 ml mikrofugerør som inneholder 125 μl keramiske perler og 125 μl mMRS buljong. Homogeniser fluer ved hjelp av en vevshomogenisator i 30 sek ved 4,0 M/sek.
    1. Alternativt kan du utelate perler og hånd homogenisere i mikrocentrifuge rør med plastpølser i 1 min.
    2. Hvis du kvantifiserer tarmmikrobiota, steriliserer overflaten fluene for å fjerne eksogene mikrober. Overfør fluer til et mikrocentrifugerør som inneholder 100 μl 70% etanol i 1 min, aspirer etanol og overfør til et nytt mikrocentrifugerør for homogeniseringer. Hvis DNA-innholdet i tarmen måles, skyll i 1 min med 0,6% natriumhypokloritt før etanolvasken.
  2. Fortynn homogenatet med 875 μl mMRS, virvel i 5 sek og rør 120 μl homogenat i den første brønnen av en mikrotiterplate.
  3. Utfør to sekvensielle 1:8-fortynninger ved hjelp av 10 μl homogenat og 70 μl MRS i de to neste brønnene.
    1. Fjern 10 μl fra den første brønnen og legg den til den andre brønnen som inneholder 70 μl MRS. Bland innholdet i den andre brønnen grundig, overfør 10 μl fra den andre brønnen til den tredje brønnen som inneholder 70 μl MRS, og bland grundig. Dette fører til 3 totale konsentrasjoner av det opprinnelige 1000 μl homogenatet: ufortynnet, 1:8 og 1:64.
  4. Overfør 10 μl av hver fortynning til en mMRS-plate (ved hjelp av en flerkanals pipet om ønskelig). Hell fatet litt for å spre fortynning flere millimeter ned agaroverflaten og la væske tørke før du flytter platen. Væsken tørker raskt på platen hvis platene er 2 dager gamle, noe som reduserer blandingen av to nærliggende dråper.
  5. Inkuber ved 30 °C i 1-2 dager. Fjern plater fra inkubatoren når de er distinkte, individuelle kolonier er synlige, og tell fra en fortynning med 10-100 isolerte kolonier.
  6. Beregn CFU per flue ved hjelp av ligningen E = C x D / P x V / F, hvor E = CFU per fly, C = antall kolonier telt, D = fortynning, P = μl belagt, V = volum av fly homogenat, og F = antall fluer homogenisert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl USA Scientific 1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701
Paintbrush Walmart 5133
Forceps Fisher 08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g
Sodium Acetate VWR 97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch) NA
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl USA Scientific 1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific Model 1395

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Tom verdi Problem
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter