콜로니 포밍 유닛 계산(CFU): 플라이 바디에서 박테리아를 정량화

Overview

Drosophila microbiota는 동물의 발달, 면역 및 생리학에 영향을 미칩니다. 이 비디오는 전신 제제에서 식민지 형성 단위를 결정하여 파리에서 박테리아를 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 4종의 세균성 종을 사용하여 노토바이오틱 조건에서 사육된 파리기술을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 코일 외에서발췌, 악삭과 노토바이오틱 조건에서 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터를 사육, J. Vis. Exp. (2016).

1. 계란을 데초리오네이트하고 멸균 식단으로 이전

1. 70%의 에탄올로 내부(측면 포함)를 분사하여 생물안전 캐비닛을 준비합니다. 실험실 조직으로 바닥을 닦고 UV 빛으로 후드를 15 분 동안 살균하십시오. 모든 비생물학적 소모품(표본컵, 페인트브러시, 집게, 폐수, 멸균수 400ml, 고가염소산나트륨 100ml)을 에탄올로 분사하고 즉시 바이오 안전 캐비닛에 배치하여 살균합니다. 15 분 동안 UV 빛으로 살균하십시오.
2. 120ml 표본 컵 또는 다른 멸균 용기에 계란으로 부시를 배치하여 2 개의 나트륨 hypochlorite 세차제 중 첫 번째를 시작합니다. 0.6% 나트륨 하이포염소용 액액을 0.6% 의 90ml를 서서히 부싱에 붓고 가장자리 바로 아래까지 붓습니다.
3. 계란을 2.5분 동안 헹구습니다. 주기적으로 집게를 사용하여 알을 다시 일시 중단하여 하이포염소염 용액에서 부시를 위아래로 움직입니다.
4. 부시를 생물 안전 캐비닛 내부에 90ml 표백제로 미리 채워진 두 번째 표본 컵으로 직접 옮기습니다.
5. 생물 안전 캐비닛 내부의 1.3 단계를 반복합니다. 두 번째 표백제 치료가 끝나면 계란은 부싱의 측면을 고수하기 시작해야합니다.
6. 생물 안전 캐비닛에서 1.7-1.8 단계를 수행하십시오.
7. 표백제를 버리고 멸균물로 부싱을 3번 씻습니다. 집게로 부싱을 이동하여 각 세척 중에 계란을 여러 번 다시 중단합니다. 세 번째 세척이 끝날 때까지 대부분의 계란은 부싱 의 측면에 부착해야합니다.
8. 에탄올에 멸균된 페인트브러시를 사용하여 부싱 측에서 멸균 식단으로 계란을 옮길 수 있습니다. 계란을 개별적으로 또는 소량으로 옮기. 바이알 당 30-50 개의 계란을 목표로하십시오. 산소가 튜브에 들어갈 수 있도록 캡을 느슨하게 둡니다. 바이알이 축축한 상태로 유지된다면 곤충 인큐베이터로 옮기십시오. 그렇지 않으면, 아래와 같이 박테리아를 추가.

2. 4 가지 세균 종을 사용하여 그노토바이오틱 파리를 만듭니다.

1. 박테리아 준비
   1. 1.1단계에서와 같이 필요한 소모품(파이펫, 파이펫 팁 박스, 멸균원원심분리관, MRS 국물 및 테스트 튜브 랙)을 갖춘 멸균 된 생물 안전 캐비닛을 준비하십시오. 생체 안전 캐비닛에 넣기 전에 에탄올에 젖은 실험실 닦아 테스트 튜브의 외부를 닦아.
   2. 박테리아를 멸균 미생물튜브로 1박 성장의 500 μl을 먼저 이송하여 박테리아를 펠렛합니다. 세균 밀도가 낮은 경우, 각 튜브에 최대 1.5 ml를 추가하거나 순차적으로 상체를 제거하고 동일한 튜브에 추가 배양을 추가합니다. 10,000 x g에서 10 분 동안 생물 안전 캐비닛및 원심 분리기에서 샘플을 제거하십시오. 필터 팁을 사용하여 샘플 간의 오염을 방지합니다.
   3. OD_600을측정하여 각 배양의 밀도를 결정한다. 다중 음판 판독기를 사용하는 경우 각 배양의 200 μl을 1, 2-및 4배 희석으로 96웰 플레이트로 옮기는다.
   4. 각 셀 펠릿(2.1.2)을 희석시키는 mMRS의 양을 분광계와 다음 방정식을 판독하는 플레이트를 이용하여 결정한다. 각 플라이 바이알에 50 μl을 접종하기에 충분한 국물을 추가할 계획입니다.
      1. 플레이트 판독 분광계에서 각 세균 배양을 1:1, 1:2 및 1:4 희석에 대한 OD₆₀₀ 판독값을 수집합니다. 0.1과 0.2 사이의 OD₆₀₀ 값을 생성하는 각 세균 균주에 대한 희석을 선택하고 2.1.4.2 또는 2.1.4.3에서 제공되는 수식에서 이 값과 해당 희석 계수를 'O'와 'D'로 사용합니다.
      2. 여기에 설명된 4종을 사용하는 경우, 세포를 상응하는 식민지 형성 유닛(CFU)/ml 밀도(OD_600에서 뉴웰 및 더글러스, Appl Environ Microbiol에서 이전에 결정된 CFU 변환으로 정상화한다. (2014)) 이 방정식을 사용 하 여:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         여기서 E = 부피가 펠릿을 재연하는 곳(μl), O = OD₆₀₀ 박테리아, B = OD₆₀₀ 빈 매체, D = 접이식 희석, V = μl 세균 배양 원심분리, C = 소정의 상수의 OD_600. 이러한 방정식을 사용하여 계산의 예를 보려면 추가 코드 파일을 참조하십시오. 자동으로 비워진 분광광계의 경우 "O-B"대신 "O"를 사용하십시오.
         참고: 소정의 상수(단위 OD_600,10⁷ CFU^ml-1로정규화, 뉴웰및 더글러스, Appl Environ Microbiol에서 유래된 상수. (2014)) 다음과 같이 다음과 같습니다 : A. tropicalis (0.052), A. 포모럼 (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. 다른 세균성 종(CFU/OD₆₀₀ 상수를 사용할 수 없음)을 사용하는 경우 이 방정식을 사용하여 ODI₆₀₀ = 0.1로 밀도를 정규화합니다.
         E = (O-B) x V x D)/0.1 OD₆₀₀
         참고: 단위는 2.1.4.2 단계와 동일합니다. 이러한 방정식을 사용하여 계산의 예를 보려면 추가 코드 파일을 참조하십시오.
   5. 생물 안전 캐비닛에서, 파이펫 팁으로 상류체를 제거하고 2.1.4.2 단계에서 계산된 신선한 mMRS 또는 PBS에서 펠릿을 재연한다.
2. 접종 박테리아
   1. 박테리아의 50 μl을 멸균 식단과 비반향계란을 생체 안전 캐비닛에 사용하여 원내 튜브로 옮기습니다. 알로알 간 오염을 방지하기 위해 계란 이송 후 박테리아를 추가합니다.
   2. 25°C의 인큐베이터에 접종된 튜브를 배치합니다.

3. 멸균을 위한 CFU 부하/테스트 측정

1. 전신 플라이 균질화의 CFU 부하를 측정하기 위해 5 파리 (5-7 일 후 백과) 세라믹 구슬 125 μl 및 mMRS 국물의 125 μl을 포함하는 1.7 ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮기십시오. 4.0 M/초에서 30초 동안 티슈 균질화를 사용하여 파리를 균질화합니다.
   1. 또는 비드를 생략하고 손으로 플라스틱 유봉이있는 미세 원심 분리기 튜브에서 1 분 동안 균질화하십시오.
   2. 장내 미생물을 정량화하면 표면이 파리를 살균하여 외인성 미생물을 제거합니다. 1분 동안 100 μl 70% 에탄올이 들어 있는 마이크로센심분리기 튜브로 이송하고, 에탄올을 흡입하고, 균질화를 위해 새로운 미세센트심분리기로 이송한다. 장의 DNA 함량이 측정되면 에탄올 세척 전에 0.6 % 나트륨 hypochlorite로 1 분 동안 헹구는다.
2. 875 μl mMRS, 5 초 동안 소용돌이, 마이크로 티터 플레이트의 첫 번째 우물에 균주 120 μl로 균동질을 희석시하십시오.
3. 다음 두 우물에서 10 μl 균주 및 70 μl MRS를 사용하여 두 개의 순차적 1:8 희석을 수행합니다.
   1. 첫 번째 우물에서 10 μl을 제거하고 70 μl MRS를 포함하는 두 번째 우물에 추가하고 두 번째 의 내용을 잘 혼합하고, 70 μl MRS를 포함하는 세 번째 우물에서 두 번째 우물에서 10 μl을 옮기고 철저히 혼합합니다. 이것은 원래 1,000 μl 균주형의 3 개의 총 농도로 이어집니다 : 희석되지 않은, 1:8 및 1:64.
4. 각 희석의 10 μl을 mMRS 플레이트로 옮김합니다(원하는 경우 다중 채널 파이펫 사용). 접시를 약간 기울어 희석제를 한천 표면 아래로 몇 밀리미터 아래로 퍼지고 접시를 움직이기 전에 액체가 건조할 수 있습니다. 플레이트가 2일 된 경우 액체가 플레이트에 빠르게 건조되어 두 개의 인접한 물방울의 혼합이 줄어듭니다.
5. 1-2 일 동안 30 °C에서 배양하십시오. 한 번 구별, 개별 식민지가 볼 수 있습니다 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 10-100 고립 된 식민지희석에서 계산합니다.
6. 비행당 E = C = C x D/P x V/F, 비행당 E= CFU, C= 카운트된 콜로니 수, D = 희석, P = μl 도금, V = 플라이 모모게네이트 부피 및 F = 균질화된 플라이 수를 사용하여 플라이당 CFU를 계산합니다.

Representative Results

추가 코드 파일: 샘플 계산. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395