गिनती कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs): मक्खी निकायों से बैक्टीरिया की मात्रा

Overview

ड्रोसोफिला माइक्रोबायोटा जानवर के विकास, प्रतिरक्षा और शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है। यह वीडियो पूरे शरीर की तैयारी से कॉलोनी बनाने इकाइयों का निर्धारण करके मक्खियों से बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल मक्खियों के साथ तकनीक को दर्शाता है, जो चार जीवाणु प्रजातियों का उपयोग करके gnotobiotic स्थितियों के तहत पाला जाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल कोयले एट अलसे एक अंश है, जो फल फ्लाई ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर अंडर एक्सेंनिक और ग्नोटोबायोटिक स्थितियां, जे विस एक्सपीका पालन करता है। (2016).

1. दधोरियोनेट अंडे और बाँझ आहार के लिए स्थानांतरण

1. 70% इथेनॉल के साथ अंदर (पक्षों सहित) छिड़ककर जैवसेफ्टी कैबिनेट तैयार करें। एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ नीचे पोंछ, और ~ 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ हुड बंध्याकरण । इथेनॉल के साथ छिड़काव और तुरंत जैवसेफ्टी कैबिनेट में रखकर सभी गैर-जैविक आपूर्ति (नमूना कप, तूलिका, संदंश, अपशिष्ट कंटेनर, 400 मिलीलीटर निष्फल पानी, और 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट के 100 मिलीलीटर) को स्टरलाइज करें। 15 मिनट के लिए यूवी लाइट के साथ स्टरलाइज करें।
2. अंडे के साथ झाड़ी को 120 मिलीलीटर नमूना कप या अन्य बाँझ कंटेनर में रखकर 2 सोडियम हाइपोक्लोराइट धोता के पहले शुरू करें। धीरे-धीरे रिम के ठीक नीचे तक बुशिंग में ~ 90 मिलीलीटर 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान डालें।
3. अंडे को 2.5 मिनट तक कुल्ला करें। समय-समय पर अंडों को फिर से निलंबित करके अंडों को हाइपोक्लोराइट समाधान में ऊपर और नीचे ले जाने के लिए संदंश का उपयोग करके।
4. बायोसेफ्टी कैबिनेट के अंदर 90 मिलीलीटर ब्लीच से पहले से भरे दूसरे नमूने कप में सीधे बुशिंग को स्थानांतरित करें।
5. जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर चरण 1.3 दोहराएं। दूसरे ब्लीच उपचार के अंत में, अंडे को झाड़ी के किनारों का पालन करना शुरू कर देना चाहिए।
6. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 1.7-1.8 कदम उठाएं।
7. ब्लीच को छोड़ दें और 3 बार बाँझ पानी से झाड़ी को धो लें। प्रत्येक धोने के दौरान अंडों को कई बार संदंश के साथ झाड़ी को स्थानांतरित करके फिर से निलंबित करें। तीसरे धोने के अंत तक अधिकांश अंडे झाड़ी के पक्ष से जुड़े होने चाहिए।
8. इथेनॉल में निष्फल पेंटब्रश का उपयोग करके, झाड़ी के किनारे से बाँझ आहार में अंडे स्थानांतरित करें। अंडे को व्यक्तिगत रूप से या छोटे बैचों में स्थानांतरित करें। प्रति शीशी 30-50 अंडे के लिए लक्ष्य। ऑक्सीजन को ट्यूब में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए टोपियां ढीली छोड़ दें। यदि शीशियों को एक्सनिक रहना है, तो एक कीट इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें; अन्यथा, नीचे बैक्टीरिया जोड़ें।

2. 4 बैक्टीरियल प्रजातियों का उपयोग करके Gnotobiotic मक्खियों बनाओ

1. बैक्टीरिया तैयार
   1. कदम 1.1 के रूप में आवश्यक आपूर्ति (पिपेट, पिपेट टिप बॉक्स, निष्फल अपकेंद्रित्र ट्यूब, श्रीमती शोरबा, और टेस्ट ट्यूब रैक) के साथ एक निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट तैयार करें। बायोसेफ्टी कैबिनेट में रखने से पहले इथेनॉल से लथपथ प्रयोगशाला पोंछ के साथ टेस्ट ट्यूबों के बाहर पोंछें।
   2. पहले एक बाँझ माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए रात भर के विकास के ५०० माइक्रोल स्थानांतरित करके बैक्टीरिया गोली । यदि बैक्टीरियल घनत्व कम है, तो प्रत्येक ट्यूब में 1.5 मिलीलीटर तक जोड़ें या क्रमिक रूप से सुपरनेट को हटा दें और एक ही ट्यूब में अतिरिक्त संस्कृति जोड़ें। बायोसेफ्टी कैबिनेट और सेंट्रलाइज से 10 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर नमूने निकालें। नमूनों के बीच संदूषण से बचने के लिए फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग करें।
   3. प्रत्येक संस्कृति का घनत्व ओडी₆₀₀मापकर निर्धारित करें . यदि एक बहु-अच्छी प्लेट रीडर का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रत्येक संस्कृति के 200 माइक्रोन को 1-, 2-और 4 गुना कमजोर पड़ने में 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
   4. एक प्लेट रीडिंग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके प्रत्येक सेल पेलेट (2.1.2) को पतला करने के लिए एमएमआरएस की मात्रा निर्धारित करें। प्रत्येक मक्खी शीशी के लिए 50 माइक्रोन टीका लगाने के लिए पर्याप्त शोरबा जोड़ने की योजना है।
      1. एक प्लेट पढ़ने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 1:1, 1:2, और 1:4 कमजोर पड़ने के लिए OD₆₀₀ रीडिंग ले लीजिए। प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव के लिए कमजोर पड़ने का चयन करें जो_0.1 और 0.2 के बीच एक ओडी 600 मूल्य का उत्पादन करता है और 2.1.4.2 या 2.1.4.3 में दिए गए सूत्रों में इस मूल्य और इसके इसी कमजोर पड़ने वाले कारक को 'ओ' और 'डी' के रूप में उपयोग करता है।
      2. यदि यहां वर्णित 4 प्रजातियों का उपयोग कर रहे हैं, तो कोशिकाओं को समकक्ष कॉलोनी बनाने इकाई (सीआईयू) /एमएल घनत्व (ओडी₆₀₀ से सीएलयू रूपांतरण के लिए न्यूवेल और डगलस, ऐपल एनवायरन माइक्रोबायॉल में पहले निर्धारित किया गया है। (2014)) इस समीकरण का उपयोग:
         ई = ((ओ-बी) x V x D)/C
         जहां ई = मात्रा में गोली resuspend करने के लिए (μl), ओ = ओडी_६०० बैक्टीरिया, बी = ओडी_६०० खाली मीडिया, डी = गुना-कमजोर पड़ने, V = μl जीवाणु संस्कृति अपकेंद्रित्र से पहले, सी = OD_६०० पूर्व निर्धारित स्थिर के । इन समीकरणों का उपयोग कर गणना के उदाहरणों के लिए पूरक कोड फ़ाइल देखें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए जो स्वचालित रूप से खाली होते हैं, "ओ-बी" के स्थान पर "ओ" का उपयोग करें।
         नोट: पूर्व निर्धारित स्थिरांक (इकाइयां ओडी_600,10^{7 सीएलयू} एमएल^-1से सामान्यीकृत, नेवेल और डगलस में प्राप्त स्थिरांक, अपील एनवायरन माइक्रोबियोल। (2014)इस प्रकार हैं: ए ट्रॉपिकलिस (0.052), ए पोमोरम (0.038), एल ब्रेविस (0.056), एल प्लांटारम (0.077)।
      3. यदि अन्य जीवाणु प्रजातियों का उपयोग करना (कोई सीएलयू/ओडी₆₀₀ स्थिर उपलब्ध नहीं है), तो इस समीकरण का उपयोग करके ओडी₆₀₀ = 0.1 घनत्व को सामान्य करें:
         ई = ((ओ-बी) x V x D)/0.1 OD₆₀₀
         नोट: इकाइयां चरण 2.1.4.2 में समान हैं। इन समीकरणों का उपयोग कर गणना के उदाहरणों के लिए पूरक कोड फ़ाइल देखें।
   5. जैवसेफ्टी कैबिनेट में, एक पिपेट टिप के साथ सुपरनैंट को हटा दें और ताजा एमएमआरएस या पीबीएस में गोली को फिर से खर्च करें जैसा कि चरण 2.1.4.2 में गणना की गई है।
2. टीका लगाने वाले बैक्टीरिया
   1. बायोसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ आहार और डिकोरियोनेटेड अंडे के साथ शंकु नलियों में बैक्टीरिया के 50 माइक्रोन स्थानांतरित करें। शीशियों के बीच संदूषण को रोकने के लिए अंडे के हस्तांतरण के बाद बैक्टीरिया जोड़ें।
   2. एक इनक्यूबेटर में टीका लगाया ट्यूब 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

3. उपाय CFU लोड/

1. पूरे शरीर फ्लाई समरूपता में आरएफयू लोड को मापने के लिए, 5 मक्खियों (5-7 दिन बाद एक क्लोज़) को 1.7 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें सिरेमिक मोतियों की 125 माइक्रोल और एमएमआरएस शोरबा का 125 माइक्रोल होता है। 4.0 एम/
   1. वैकल्पिक रूप से, 1 मिनट के लिए प्लास्टिक कीट के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में मोतियों और हाथ को छोड़ दें।
   2. यदि आंत माइक्रोबायोटा की मात्रा निर्धारित करते हैं, तो सतह बहिर्जात रोगाणुओं को हटाने के लिए मक्खियों को निष्फल कर देती है। 1 मिनट के लिए 100 माइक्रोल 70% इथेनॉल युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें, इथेनॉल को बढ़ाएं, और समरूपता के लिए एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि आंत की डीएनए सामग्री को मापा जाएगा, तो इथेनॉल धोने से पहले 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ 1 मिनट के लिए कुल्ला करें।
2. 875 माइक्रोल एमएमआरएस के साथ समरूप को पतला करें, 5 सेकंड के लिए भंवर, और माइक्रोटिटर प्लेट के पहले कुएं में होमोजेनेट के 120 माइक्रोल।
3. अगले दो कुओं में 10 माइक्रोन समरूप और 70 माइक्रोन एमआरएस का उपयोग करके दो अनुक्रमिक 1:8 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
   1. पहली अच्छी तरह से 10 माइक्रोन निकालें और इसे 70 माइक्रोन एमआरएस युक्त दूसरे कुएं में जोड़ें। दूसरे कुएं की सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं, दूसरे कुएं से 10 माइक्रोन को 70 माइक्रोन एमआरएस युक्त तीसरे कुएं में स्थानांतरित करें, और अच्छी तरह से मिलाएं। यह मूल 1,000 माइक्रोन समरूप की कुल सांद्रता की ओर जाता है: बिना पतला, 1:8, और 1:64।
4. प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन को एक एमएमआरएस प्लेट में स्थानांतरित करें (यदि वांछित हो तो मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके)। आगर की सतह के नीचे कई मिलीमीटर कमजोर पड़ने को फैलाने के लिए पकवान को थोड़ा झुकाएं और प्लेट को आगे बढ़ने से पहले तरल सूखने दें। यदि प्लेटें 2 दिन पुरानी हैं, तो प्लेट पर तरल जल्दी सूख जाता है, जिससे दो पड़ोसी बूंदों के मिश्रण को कम किया जा सकता है।
5. 1-2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक बार अलग होने के बाद इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाएं, अलग-अलग उपनिवेश दिखाई दे रहे हैं, और 10-100 अलग-थलग उपनिवेशों के साथ एक कमजोर पड़ने से गिनती करें।
6. समीकरण ई = सी एक्स डी/पी एक्स V/F, जहां ई = CFU प्रति मक्खी, सी = गिनती कालोनियों की संख्या, डी = कमजोर पड़ने की संख्या, पी = μl चढ़ाया, वी = फ्लाई समरूप की मात्रा, और मक्खियों की संख्या समरूप का उपयोग कर प्रति फ्लाई की गणना करें ।

Representative Results

पूरक कोड फ़ाइल: नमूना गणना। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें) ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395