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Encyclopedia of Experiments

计数殖民地形成单位(CF):从飞体中量化细菌

Overview

嗜血杆菌 微生物影响动物的发育、免疫力和生理。此视频描述了一种通过确定来自全身制剂的菌落形成单位来量化苍蝇细菌的方法。特色协议演示了使用四种细菌在侏罗万象条件下饲养的苍蝇的技术。

Protocol

本协议是科伊尔等人的摘录,在阿克塞尼奇和侏罗育条件下饲养果蝇德罗索菲拉梅拉诺加斯特,J.Vis.Exp 。(2016).

1. 降矮鸡蛋并转移到无菌饮食

  1. 通过向内部(包括侧面)喷洒 70% 乙醇来准备生物安全柜。用实验室组织擦拭底部,用紫外线对发动机罩进行消毒约 15 分钟。通过喷洒乙醇并立即放入生物安全柜,对所有非生物用品(标本杯、画笔、钳子、废容器、400毫升消毒水和100毫升0.6%次氯酸钠)进行消毒。用紫外线消毒15分钟。
  2. 开始第一次2次次次氯酸钠洗涤,将与鸡蛋的灌木放入120毫升标本杯或其他无菌容器。慢慢地将 ~90 毫升 0.6% 的次氯酸钠溶液倒入灌木丛中,直到边缘以下。
  3. 冲洗鸡蛋2.5分钟。定期使用钳子在次氯酸盐溶液中上下移动衬套来重新悬浮卵子。
  4. 将灌木直接转移到生物安全柜内的第二个标本杯中,预装满 90 毫升漂白剂。
  5. 在生物安全柜内重复步骤 1.3。在第二次漂白处理结束时,鸡蛋应开始粘附在灌木的两侧。
  6. 在生物安全柜中执行步骤 1.7-1.8。
  7. 丢弃漂白剂,用无菌水清洗灌木3次。每次洗涤时,通过用钳子移动衬套,将鸡蛋重新悬浮数次。到第三次清洗结束时,大多数鸡蛋应该附着在灌木丛的一侧。
  8. 使用在乙醇中消毒的画笔,将鸡蛋从灌木丛的一侧转移到无菌饮食中。单独或分批转移鸡蛋。目标是每瓶30-50个鸡蛋。让帽子松动,让氧气进入管子。如果小瓶要保持斧头,转移到昆虫孵化器:否则,在下面添加细菌。

2. 使用4种细菌制造侏罗育蝇

  1. 准备细菌
    1. 按照步骤 1.1,准备一个消毒的生物安全柜,内有必要的用品(移液器、移液器尖端盒、消毒离心机管、MRS 汤和试管架)。在放入生物安全柜之前,先用浸泡在乙醇的实验室湿巾擦拭试管外部。
    2. 首先将500μl的隔夜生长转移到无菌微胶管中,使细菌颗粒化。如果细菌密度低,将每个管子加起来1.5毫升,或按顺序去除超物质,并在同一管中添加额外的培养。以 10,000 x g 的速度从生物安全柜和离心机中取出样品 10 分钟。使用滤芯提示以避免样品之间的污染。
    3. 通过测量OD600来确定每个培养的密度。如果使用多井板读取器,将每个培养物的 200 μl 以 1-、2 和 4 倍稀释将 96 井板传输到 96 井板中。
    4. 使用板读数光谱仪和以下方程确定稀释每个细胞颗粒(2.1.2)的 mMRS 量。计划添加足够的汤,为每只飞小瓶接种50微克。
      1. 在板读光谱仪上收集OD600 读数,以1:1、1:2和1:4稀释每个细菌培养物。选择在0.1 和 0.2 之间产生 OD 600 值的每个细菌菌株的稀释,并在 2.1.4.2 或 2.1.4.3 给出的公式中使用此值及其相应的稀释因子为"O"和"D"。
      2. 如果使用此处描述的 4 个物种,将细胞标准化为等效的菌落形成单元 (CFU)/毫升密度 (OD600 到 CFU 转换以前在 纽厄尔和道格拉斯确定, 应用环境微生物。(2014)) 使用此等式:
        E = (O-B) x V x D/C
        其中 E = 在离心前补充颗粒的体积 (μl), O =OD 600 细菌, B =OD 600 空白介质, D = 折叠稀释, V = 离心前的 μl 细菌培养, C = 预先确定常数的OD 600 。有关使用这些方程的计算示例,请参阅补充代码文件。对于自动空白的光谱仪,请使用"O"代替"O-B"。
        注: 预先确定的常数(单位OD600,规范化到107 CFU毫升-1,常数衍生在 纽厄尔和道格拉斯,应用环境微生物。(2014)) 如下: A. 热带 (0.052), A. 波莫鲁姆 (0.038), L. 布雷维斯 (0.056), L. 植物 (0.077).
      3. 如果使用其他细菌物种(没有CFU/OD 600 常数可用),则使用此等式将密度标准化为OD 600 = 0.1:
        E = (O-B) x V x D)/0.1 OD600
        注: 单位与步骤 2.1.4.2 相同。有关使用这些方程的计算示例,请参阅 补充代码文件
    5. 在生物安全柜中,用吹笛尖取出超自然物质,并按步骤 2.1.4.2 计算,在新鲜的 mMRS 或 PBS 中重新注入颗粒。
  2. 接种细菌
    1. 将 50 μl 的细菌转移到圆锥管中,进行无菌饮食,并在生物安全柜中排出鸡蛋。在鸡蛋转移后加入细菌,以防止小瓶之间的污染。
    2. 将接种管放置在 25 °C 的孵化器中。

3. 测量CFU无菌性负载/测试

  1. 为了测量全身飞行同质化的CFU负荷,将5只苍蝇(5-7天后)转移到含有125微珠和125毫升mMRS汤的1.7毫升微胶管中。以 4.0 M/秒的速度使用组织同质化剂使苍蝇同质化 30 秒。
    1. 或者,省略珠子和手在微中线管与塑料害虫同质化1分钟。
    2. 如果量化肠道微生物群,表面消毒苍蝇以去除外源微生物。将苍蝇转移到含有 100 μl 70% 乙醇的微中燃料管中,1 分钟,吸气乙醇,并转移到新的微中燃料管中进行均质化。如果要测量肠道的DNA含量,在洗乙醇之前用0.6%的次氯酸钠冲洗1分钟。
  2. 用 875μl mMRS 稀释同质酸盐,涡流 5 秒,并将 120 μl 的同质酸盐输送到微酸盐板的第一口井中。
  3. 在接下来的两口井中使用 10μl 同质化和 70μl MRS 执行两个连续 1:8 稀释。
    1. 从第一口井中取出 10 μl,并将其添加到包含 70μl MRS 的第二口井中,彻底混合第二口油井的内容,将 10 μl 从第二口井转移到第三口含有 70 μl MRS 的井中,然后彻底混合。这导致原始 1,000μl 同质物的总浓度为 3:未稀释、1:8 和 1:64。
  4. 将每个稀释的 10μl 传输到 mMRS 板(如果需要,使用多通道管道)。稍微倾斜菜,将稀释剂向下摊开几毫米,让液体在移动盘子之前干燥。如果板有2天大,液体会迅速干燥,减少两个相邻水滴的混合。
  5. 在30°C孵育1-2天。从孵化器中取出板,一旦不同,个别殖民地是可见的,并从稀释与10-100个孤立的殖民地计数。
  6. 使用等式 E = C x D/P x V/F 计算每只苍蝇的 CFU,其中 E = CFU 每只苍蝇,C = 计算的菌落数量,D = 稀释,P = μl 镀层,V = 苍蝇同质化体积,F = 苍蝇数量均质化。

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Representative Results

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG
Agar Fisher--Lab Scientific fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102
Plastic Bushing Home Depot 100404002
Plastic Bushing Cap Home Depot 100153897
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067
Repeater M4 Eppendorf 4982000322
50 ml Centrifuge Tubes TrueLine Centrifuge Tubes TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl USA Scientific 1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701
Paintbrush Walmart 5133
Forceps Fisher 08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g
Sodium Acetate VWR 97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch) NA
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl USA Scientific 1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific Model 1395

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