Overview
ショウジョウバエ 微生物叢は、動物の発達、免疫および生理学に影響を与える。このビデオでは、全身製剤からコロニー形成ユニットを決定することによってハエから細菌を定量化する方法について説明します。注目のプロトコルは、4つの細菌種を使用してグノトバイオティクス条件下で飼育されたハエを用いた技術を実証する。
Protocol
このプロトコルは、Koyle らからの抜粋であり、無菌およびグノトビオティック条件下でのフルーツフライ ショウジョウバエメラノガスター の飼育 、J.Vis. Exp.(2016).
1. デコールリオネート卵と滅菌食への移行
- 70%エタノールを内部(側面を含む)にスプレーしてバイオセーフティキャビネットを準備します。ラボティッシュで底を拭き、約15分間UV光でボンネットを殺菌します。エタノールを噴霧し、すぐにバイオセーフティキャビネットに入れることで、非生物学的な供給(標本カップ、ペイントブラシ、鉗子、廃液、400ml滅菌水、および100mlの次亜塩素酸ナトリウム)を殺菌します。15分間、UV光で殺菌します。
- 卵でブッシュを120mlの標本カップまたは他の滅菌容器に入れることによって、2回の次亜塩素酸ナトリウムの最初の水解を開始します。リムのすぐ下まで、0.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液をブッシングにゆっくりと90ml流します。
- 卵を2.5分間すすいでください。鉗子を使用して卵を定期的に再中断し、次亜塩素酸溶液中でブッシングを上下に動かします。
- バイオセーフティキャビネット内の90ml漂白剤で事前に充填された2番目の標本カップに直接ブッシュを移します。
- バイオセーフティキャビネット内でステップ1.3を繰り返します。2回目の漂白処理の終わりに、卵はブッシングの側面に付着し始めるはずです。
- バイオセーフティキャビネットでステップ1.7-1.8を実行します。
- 漂白剤を捨て、滅菌水でブッシングを3回洗います。鉗子でブッシングを動かすことによって、各洗浄中に卵を数回再中断します。3回目の洗浄の終わりまでに、ほとんどの卵はブッシングの側面に取り付けられるべきです。
- エタノールで殺菌したペイントブラシを使用して、ブッシングの側面から無菌食に卵を移す。卵を個別に、または小さなバッチで転送します。バイアルあたり30〜50個の卵を目指します。酸素がチューブに入るようにキャップを緩めたままにしておきます。バイアルが無数のままである場合は、昆虫のインキュベーターに移します。それ以外の場合は、以下のように細菌を追加します。
2. 4つの細菌種を用いてグノトビオティックハエを作る
- 細菌を準備する
- ステップ 1.1 のように、必要な供給(ピペット、ピペットチップボックス、滅菌遠心管、MRSブロス、試験管ラック)を備えた殺菌バイオセーフティキャビネットを準備します。バイオセーフティキャビネットに入れる前に、エタノール浸しの実験室で拭いて試験管の外側を拭いてください。
- ペレット菌は、まず一晩に500μlの増殖を無菌マイクロフュージチューブに移した。細菌密度が低い場合は、各チューブに1.5mlまで加えるか、上清を順次除去し、同じチューブに余分な培養を加えます。バイオセーフティキャビネットと遠心分離機から10,000 x gで10分間サンプルを取り除く。サンプル間の汚染を避けるためにフィルターチップを使用してください。
- OD600を測定して各培養の密度を決定する。マルチウェルプレートリーダーを使用する場合は、各培養液の200 μlを1、2、4倍の希釈液で96ウェルプレートに移します。
- プレート読み取り分光度計と以下の式を用いて、各細胞ペレット(2.1.2)を希釈するmMRSの量を決定します。各フライバイアルに50 μlを接種するのに十分なスープを追加する予定です。
- プレート読み取り分光光度計で各細菌培養液の1:1、1:2、および1:4希釈のためのOD600 の測定値を収集します。0.1 から 0.2 の間で OD600 値を生成する各細菌株の希釈を選択し、2.1.4.2 または 2.1.4.3 で示した式で、この値とそれに対応する希釈係数を 「O」 および 「D」として使用します。
- ここで説明する4種を用いる場合、細胞を等価コロニー形成ユニット(CFU)/ml密度(前にニューウェル及びダグラス、Appl Environ Microbiolで決定したCFUへのOD600 変換)に正常化 する。(2014))この 方程式を使用して:
E = ((O-B) x V x D)/C
ここでE=ペレットを再懸濁する体積(μl)、O=OD600細菌、B=OD600ブランク培地、D=フォールド希釈、V=μl細菌培養、C=所定の定数のOD600。 これらの関係式を使用した計算の例については、「補足コード ファイル」を参照してください。自動的にブランクになる分光光度計の場合は、「O-B」の代わりに「O」を使用します。
注:所定の定数(単位OD600、107 CFUml-1に正規化され、ニューウェルおよびダグラスに由来する定数、Appl Environ Microbiol。(2014)は、A.トロピカル(0.052)、A.ポモラム(0.038)、L.brevis(0.056)、L.プランタラム(0.077)です。 - 他の細菌種を使用する場合(CFU/OD600 定数が使用できません)、次の式を使用して、密度を OD600 = 0.1 に正規化します。
E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD600
注: 単位は、ステップ 2.1.4.2 と同じです。これらの関係式を使用した計算の例については、「 補足コード ファイル 」を参照してください。
- バイオセーフティキャビネットで、ピペットチップで上清を取り除き、ステップ2.1.4.2で計算した新鮮なmMRSまたはPBSでペレットを再懸濁します。
- イノキュレート細菌
- 細菌の50 μlを、生物安全キャビネットの滅菌食とデコリオネート卵を用いた円錐管に移します。卵の移入後に細菌を加えて、バイアル間の汚染を防ぎます。
- 接種チューブをインキュベーターに25°Cで入れる。
3. CFU負荷/試験の無菌性測定
- 全身フライホモジネイトのCFU負荷を測定するには、5ハエ(5-7日後のエロージョン)を1.7ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、125μlのセラミックビーズと125 μlのmMRSブロスを含みます。4.0 M/秒で30秒間組織ホモジナイザーを使用してハエをホモジナイズする。
- あるいは、ビーズを省略し、1分間プラスチック害虫でマイクロ遠心チューブで手均質化します。
- 腸内微生物叢を定量する場合、表面は外因性微生物を除去するためにハエを殺菌する。100 μl 70% エタノールを含むマイクロ遠心布管にハエを 1 分間、吸気エタノール、および新しいマイクロ遠心分離管に移して均質化します。もし腸のDNA含有量を測定するなら、エタノール洗浄の前に0.6%次亜塩素酸ナトリウムで1分間洗い流す。
- ホモゲネートを875 μl mMRS、渦を5秒間、ピペット120 μlのホモジネートをマイクロタイタープレートの最初のウェルに希釈します。
- 次の2つのウェルで10 μlホモジネートと70 μl MRSを使用して、2つのシーケンシャルな1:8希釈を行います。
- 1番目のウェルから10 μlを取り出し、70 μl MRSを含む2番目のウェルに加え、2番目のウェルの内容を完全に混ぜ、2番目のウェルから70 μl MRSを含む第3ウェルに10μlを移し、十分に混ぜます。これは元の1,000 μlホモジネートの3つの総濃度を導く:希薄化、1:8および1:64。
- 各希釈液の10 μlをmMRSプレートに移します(必要に応じてマルチチャンネルピペレットを使用)。皿を少し傾斜させて、寒天表面の下に数ミリメートルの希釈液を広げ、プレートを動かす前に液体を乾燥させます。プレートが2日経った場合、液体はプレート上で素早く乾燥し、隣接する2つの液滴の混合を減らします。
- 30°Cで1〜2日間インキュベートします。一度分かると、個々のコロニーが見えるようにインキュベーターからプレートを取り除き、10〜100個の孤立したコロニーを含む希釈から数える。
- E = C x D/P x V/F、E = C = コロニー数、D = 希釈数、P =μlメッキ、V = フライホモジネートの体積、F = ホモジナイズされたハエの数を使用して、フライ当たり CFU を計算します。
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Representative Results
補足コード ファイル: サンプル計算。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | |
| Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100404002 | |
| Plastic Bushing Cap | Home Depot | 100153897 | |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | |
| Filter Pipette Tips, 300 µl | USA Scientific | 1120-9810 | |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | |
| Forceps | Fisher | 08-882 | |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Filter Pipette Tips, 1,000 µl | USA Scientific | 1122-1830 | |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 |
