Colony Forming Units (CFUs) tellen: bacteriën uit vlieglichamen kwantificeren

Overview

Drosophila microbiota beïnvloedt de ontwikkeling, immuniteit en fysiologie van het dier. Deze video beschrijft een methode om bacteriën uit vliegen te kwantificeren door de kolonievormende eenheden van hele lichaamspreparaten te bepalen. Het aanbevolen protocol demonstreert de techniek met vliegen, gekweekt onder gnotobiotische omstandigheden met behulp van vier bacteriesoorten.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Dechorionaat eieren en overdracht naar steriel dieet

1. Bereid de bioveiligheidskast voor door de binnenkant (inclusief zijkanten) te besproeien met 70% ethanol. Veeg de bodem af met een laboratoriumweefsel en steriliseer de kap gedurende ~ 15 minuten met UV-licht. Steriliseer alle niet-biologische benodigdheden (monsterbekers, penseel, tang, afvalcontainer, 400 ml gesteriliseerd water en 100 ml 0,6% natriumhypochloriet) door te spuiten met ethanol en onmiddellijk in de bioveiligheidskast te plaatsen. Steriliseer met UV-licht gedurende 15 minuten.
2. Begin de eerste van 2 natriumhypochlorietwassingen door de bus met de eieren in een monsterbeker van 120 ml of een andere steriele container te plaatsen. Giet langzaam ~90 ml 0,6% natriumhypochlorietoplossing in de bus tot net onder de rand.
3. Spoel de eieren 2,5 min. Hang de eieren regelmatig opnieuw op met behulp van een tang om de bus op en neer te bewegen in de hypochlorietoplossing.
4. Breng de bus rechtstreeks over in een tweede monsterbeker, voorgevuld met 90 ml bleekmiddel, in de bioveiligheidskast.
5. Herhaal stap 1.3 in de bioveiligheidskast. Aan het einde van de tweede bleekbehandeling moeten de eieren zich aan de zijkanten van de bus beginnen te hechten.
6. Voer stap 1.7-1.8 uit in de bioveiligheidskast.
7. Gooi het bleekmiddel weg en was de bus 3 keer met steriel water. Hang de eieren tijdens elke wasbeurt meerdere keren opnieuw op door de bus met een tang te verplaatsen. Tegen het einde van de derde wasbeurt moeten de meeste eieren aan de zijkant van de bus worden bevestigd.
8. Breng met behulp van een penseel gesteriliseerd in ethanol eieren over van de zijkant van de bus naar het steriele dieet. Breng eieren afzonderlijk of in kleine batches over. Streef naar 30-50 eieren per flacon. Laat de doppen los zodat er zuurstof in de buis kan komen. Als flacons axenisch moeten blijven, breng dan over naar een insectenincubator; voeg anders bacteriën toe zoals hieronder.

2. Maak gnotobiotische vliegen met behulp van 4 bacteriële soorten

1. Bereid bacteriën voor
   1. Bereid een gesteriliseerde bioveiligheidskast voor met de nodige benodigdheden (pipetten, pipettipboxen, gesteriliseerde centrifugebuizen, MRS-bouillon en reageerbuisrekken) zoals in stap 1.1. Veeg de buitenkant van de reageerbuizen af met een met ethanol doordrenkt laboratoriumdoekje voordat u het in de bioveiligheidskast plaatst.
   2. Pellet de bacteriën door eerst 500 μl 's nachts groei over te brengen naar een steriele microfuge buis. Als de bacteriële dichtheid laag is, voeg dan tot 1,5 ml toe aan elke buis of verwijder opeenvolgend supernatant en voeg extra cultuur toe aan dezelfde buis. Verwijder monsters uit de bioveiligheidskast en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 x g. Gebruik filtertips om verontreiniging tussen monsters te voorkomen.
   3. Bepaal de dichtheid van elke cultuur door OD₆₀₀te meten . Als u een multi-well plaatlezer gebruikt, breng dan 200 μl van elke cultuur over op een 96-putplaat in 1-, 2- en 4-voudige verdunningen.
   4. Bepaal de hoeveelheid mMRS waarin elke celkorrel (2.1.2) moet worden verdund met behulp van een spectrofotometer voor plaatuitlezing en de volgende vergelijkingen. Plan om voldoende bouillon toe te voegen om 50 μl aan elke vliegflacon te enten.
      1. Verzamel OD_600-metingen voor een verdunning van 1:1, 1:2 en 1:4 van elke bacteriecultuur op een plaatleesspectrofotometer. Selecteer de verdunning voor elke bacteriestam die een OD_600-waarde tussen 0,1 en 0,2 produceert en gebruik deze waarde en de overeenkomstige verdunningsfactor als "O" en "D" in de formules in 2.1.4.2 of 2.1.4.3.
      2. Bij gebruik van de hier beschreven 4 soorten normaliseren cellen tot equivalente kolonievormende eenheid (CFU)/ml dichtheden (OD₆₀₀ tot CFU conversie eerder bepaald in Newell en Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) met behulp van deze vergelijking:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         waarbij E = volume tot resuspend pellet in (μl), O = OD₆₀₀ bacteriën, B = OD₆₀₀ blanco media, D = vouwverdunning, V = μl bacteriecultuur voorafgaand aan centrifugeren, C = OD₆₀₀ van vooraf bepaalde constante. Zie Aanvullend codebestand voor voorbeelden van berekeningen met behulp van deze vergelijkingen. Voor spectrofotometers die automatisch leeg zijn, gebruikt u "O" in plaats van "O-B".
         OPMERKING: De vooraf bepaalde constanten (eenheden OD₆₀₀, genormaliseerd tot 10⁷ KVE ml^-1, constanten afgeleid in Newell en Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) zijn als volgt: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Als u andere bacteriesoorten gebruikt (er is geen CFU/OD_{600-constante} beschikbaar), normaliseer de dichtheid tot OD₆₀₀ = 0,1 met behulp van deze vergelijking:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         OPMERKING: Eenheden zijn hetzelfde als in stap 2.1.4.2. Zie Aanvullend codebestand voor voorbeelden van berekeningen met behulp van deze vergelijkingen.
   5. Verwijder in de bioveiligheidskast supernatant met een pipetpunt en resuspendeer de pellet in verse mMRS of PBS zoals berekend in stap 2.1.4.2.
2. Bacteriën enten
   1. Breng 50 μl van de bacteriën over naar de conische buizen met steriel dieet en gedechorioneerde eieren in de bioveiligheidskast. Voeg bacteriën toe na eioverdracht om besmetting tussen flacons te voorkomen.
   2. Plaats ingeënte buizen in een incubator bij 25 °C.

3. Meet de CFU-belasting/test op steriliteit

1. Om de CFU-belasting in het hele lichaam te meten, moet u 5 vliegen (5-7 dagen na eclosie) overbrengen naar een microfugebuis van 1,7 ml met 125 μl keramische kralen en 125 μl mMRS-bouillon. Homogeniseer vliegen met behulp van een weefselhomogenisator gedurende 30 sec bij 4,0 M/sec.
   1. Als alternatief kunt u kralen weglaten en met de hand homogeniseren in microcentrifugebuizen met plastic stampers gedurende 1 min.
   2. Bij kwantificering van de darmmicrobiota steriliseren de vliegen om exogene microben te verwijderen. Breng vliegen over naar een microcentrifugebuis met 100 μl 70% ethanol gedurende 1 min, aspireer ethanol en breng over naar een nieuwe microcentrifugebuis voor homogenisaties. Als het DNA-gehalte van de darm wordt gemeten, spoel dan gedurende 1 minuut met 0,6% natriumhypochloriet voordat u de ethanolwast.
2. Verdun het homogenaat met 875 μl mMRS, vortex gedurende 5 sec en pipet 120 μl homogenaat in de eerste put van een microtiterplaat.
3. Voer twee opeenvolgende 1:8 verdunningen uit met 10 μl homogenaat en 70 μl MRS in de volgende twee putten.
   1. Haal 10 μl uit de eerste put en voeg deze toe aan de tweede put met 70 μl MRS. Meng de inhoud van de tweede put grondig, breng 10 μl over van de tweede put naar de derde put met 70 μl MRS en meng grondig. Dit leidt tot 3 totale concentraties van het oorspronkelijke homogenaat van 1.000 μl: onverdund, 1:8 en 1:64.
4. Breng 10 μl van elke verdunning over op een mMRS-plaat (indien gewenst met behulp van een meerkanaalspipet). Schuine schaal om de verdunning enkele millimeters over het agaroppervlak te verspreiden en vloeistof te laten drogen voordat u de plaat verplaatst. De vloeistof droogt snel op de plaat als de platen 2 dagen oud zijn, waardoor het mengen van twee naburige druppels wordt verminderd.
5. Incubeer bij 30 °C gedurende 1-2 dagen. Verwijder platen uit de incubator zodra ze duidelijk zijn, individuele kolonies zijn zichtbaar en tel uit een verdunning met 10-100 geïsoleerde kolonies.
6. Bereken CFU per vlieg met behulp van de vergelijking E = C x D/P x V/F, waarbij E = CFU per vlieg, C = aantal getelde kolonies, D = verdunning, P = μl geplateerd, V = volume vlieghomogenaat en F = aantal gehomogeniseerde vliegen.

Representative Results

Aanvullend codebestand: voorbeeldberekeningen. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395