Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Detektion av mitofagi i Caenorhabditis elegans och däggdjursceller med användning av organellspecifika färgämnen

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65337
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Att utforska mitofagi genom elektronmikroskopi, genetiska sensorer och immunofluorescens kräver dyr utrustning, kompetent personal och en betydande tidsinvestering. Här demonstrerar vi effekten av ett kommersiellt fluorescensfärgningskit för att kvantifiera mitofagiprocessen i både Caenorhabditis elegans och en levercancercellinje.

Abstract

Mitokondrier är viktiga för olika biologiska funktioner, inklusive energiproduktion, lipidmetabolism, kalciumhomeostas, hembiosyntes, reglerad celldöd och generering av reaktiva syreradikaler (ROS). ROS är avgörande för viktiga biologiska processer. Men när de är okontrollerade kan de leda till oxidativ skada, inklusive mitokondriell skada. Skadade mitokondrier släpper ut mer ROS, vilket intensifierar cellulär skada och sjukdomstillståndet. En homeostatisk process som heter mitokondriell autofagi (mitofagi) tar selektivt bort skadade mitokondrier, som sedan ersätts av nya. Det finns flera mitofagivägar, med den gemensamma slutpunkten är nedbrytningen av de skadade mitokondrierna i lysosomer.

Flera metoder, inklusive genetiska sensorer, antikroppsimmunofluorescens och elektronmikroskopi, använder denna slutpunkt för att kvantifiera mitofagi. Varje metod för att undersöka mitofagi har sina fördelar, såsom specifik vävnad / cellinriktning (med genetiska sensorer) och stor detalj (med elektronmikroskopi). Dessa metoder kräver dock ofta dyra resurser, utbildad personal och en lång förberedelsetid före själva experimentet, till exempel för att skapa transgena djur. Här presenterar vi ett kostnadseffektivt alternativ för att mäta mitofagi med kommersiellt tillgängliga fluorescerande färgämnen riktade mot mitokondrier och lysosomer. Denna metod mäter effektivt mitofagi i nematoden Caenorhabditis elegans och humana leverceller, vilket indikerar dess potentiella effektivitet i andra modellsystem.

Introduction

Mitokondrier är viktiga för alla aeroba djur, inklusive människor. De omvandlar biomolekylernas kemiska energi till adenosintrifosfat (ATP) via oxidativ fosforylering1, syntetiserar heme2, bryter ned fettsyror genom β oxidation3, reglerar kalcium4 och järn 5-homeostas, kontrollerar celldöd genom apoptos6 och genererar reaktiva syreradikaler (ROS), som spelar en viktig roll i redoxhomeostas7. Två komplementära och motsatta processer upprätthåller mitokondriernas integritet och korrekta funktion: syntesen av nya mitokondriella komponenter (biogenes) och selektivt avlägsnande av skadade genom mitokondriell autofagi (dvs mitofagi)8.

Flera mitofagivägar medieras av enzymer, såsom PINK1 / Parkin, och receptorer, inklusive FUNDC1, FKBP8 och BNIP / NIX 9,10. I synnerhet kan den selektiva nedbrytningen av mitokondriella komponenter ske oberoende av autofagosommaskineriet (dvs. genom mitokondriella härledda vesiklar)11. Endpoints för de olika selektiva mitofagivägarna är dock likartade (dvs. mitokondriell nedbrytning av lysosomala enzymer)12,13. Av denna anledning bygger olika metoder för att identifiera och mäta mitofagi på samlokalisering av mitokondriella och lysosomala markörer 14,15,16,17 och minskade nivåer av mitokondriella proteiner/mitokondriellt DNA 18.

Nedan följer en kortfattad beskrivning av de befintliga experimentella metoderna för mätning av mitofagi i djurceller med hjälp av fluorescensmikroskopi, med betoning på mitofagislutpunktsfasen.

Mitophagy biosensorer
Mitokondriell nedbrytning sker inom den sura miljön i lysosomen19. Därför upplever mitokondriella komponenter, inklusive proteiner, ett skifte från ett neutralt till ett surt pH vid slutpunkten för mitofagiprocessen. Detta mönster ligger till grund för verkningsmekanismen för flera mitofagibiosensorer, inklusive mito-Rosella18 och tandem mCherry-GFP-FIS114. Dessa sensorer innehåller ett pH-känsligt grönt fluorescensprotein (GFP) och ett pH-okänsligt rött fluorescensprotein (RFP). Därför sjunker det gröna till röda fluorescensförhållandet signifikant vid mitofagiens slutpunkt på grund av släckningen av GFP-fluoroforen. De största begränsningarna hos dessa sensorer är (1) möjlig Förster-resonansenergiöverföring (FRET) mellan fluoroforerna; (2) den differentierade mognadsgraden för GFP och RFP; (3) dissociation mellan GFP och RFP på grund av proteolytisk klyvning av polypeptiden som förbinder dem; 4) Överlappning mellan fluorescens och emission. och (5) differentiell fluoroforljusstyrka och släckning15,16.

En sensor som övervinner några av dessa begränsningar är Keima mitokondriell sensor17. mt-Keima-sensorn (härledd från korallproteinet Keima) visar en enda emissionstopp (620 nm). Dess excitationstoppar är dock pH-känsliga. Som ett resultat sker en övergång från en grön excitation (440 nm) till en röd (586 nm) vid övergång från ett högt pH till ett surt pH16,17. En nyare mitofagisensor, Mito-SRAI, har avancerat fältet genom att möjliggöra mätningar i fasta biologiska prover20. Men trots de många fördelarna med genetiska sensorer, såsom förmågan att uttrycka dem i specifika vävnader / celler och rikta dem till distinkta mitokondriella fack, har de också begränsningar. En begränsning är att de genetiska sensorerna behöver uttryckas i celler eller djur, vilket kan vara tidskrävande och resurskrävande.

Dessutom kan uttrycket av sensorerna inom mitokondrierna själva påverka mitokondriell funktion. Till exempel, att uttrycka mitokondriell GFP (mtGFP) i C. elegans maskkroppsväggsmuskler expanderar mitokondriellt nätverk21. Denna fenotyp beror på funktionen hos den stressaktiverade transkriptionsfaktorn ATFS-1, som spelar en viktig roll vid aktivering av veckat proteinsvar i mitokondrier (UPRmt)21. Därför, även om genetiskt kodade mitokondrier / mitofagibiosensorer är extremt användbara för övervakning av mitokondriernas homeostas in vivo, kan de påverka själva processen de är utformade för att mäta.

Mitokondrier/lysosomspecifika antikroppar och färgämnen
En annan strategi för att testa mitokondriell/lysosomsamlokalisering är att använda antikroppar mot mitokondriella/lysosomala proteiner, såsom det mitokondriella yttermembranproteinet TOM20 och lysosomalt associerat membranprotein 1 (LAMP1)22. I de flesta fall används sekundära antikroppar som är konjugerade till en fluorofor för att detektera fluorescenssignalen via mikroskopi. En annan strategi är att kombinera genetiska konstruktioner med mitokondriella/lysosomala färgämnen, såsom att uttrycka en LAMP1::GFP-fusionskonstruktion i celler samtidigt som de färgas med ett rött mitokondriellt färgämne (t.ex. Mitotracker Red)16. Dessa metoder, även om de är effektiva, kräver specifika antikroppar och involverar ofta att arbeta med fasta prover eller generera celler / transgena djur som uttrycker fluorescerande märkta mitokondrier / lysosomer.

Här beskriver vi användningen av ett kommersiellt lysosom/mitokondrier/nukleärt färgningskit för att bedöma mitofagiaktiverande egenskaper hos syntetisk diamin O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin), nedan kallad VL-85023, i C. elegans-maskar och den humana cancercellinjen Hep-3B (figur 1). Färgningssatsen innehåller en blandning av lysosomala / mitokondriella / kärnriktade färgämnen som specifikt fläckar dessa organeller23. Vi har tidigare använt detta kit för att demonstrera mitofagiaktiviteten hos 1,8 diaminooktan (nedan kallad VL-004) i C. elegans23. Viktigt är att vi validerade färgningssatsresultaten med mito-Rosella-biosensorn och qPCR-mätningar av mitokondriell: nukleärt DNA-innehåll23. Detta färgningssats erbjuder följande fördelar. För det första finns det inget behov av att generera transgena djur eller celler som uttrycker en mitokondriell biosensor. Därför kan vi studera omodifierade vilda djur eller celler och därmed spara mycket tid, pengar och arbete. Dessutom, som nämnts, kan uttryck för mitokondriella biosensorer förändra mitokondriell funktion. För det andra är satsen kostnadseffektiv, enkel att använda och snabb. För det tredje, även om vi demonstrerar metoden i C. elegans och humana celler, kan den modifieras för andra celltyper och organismer.

Med det sagt, som alla metoder, har färgningssatsprotokollet nackdelar. Till exempel utförs inkubationen av maskarna med reagenset i frånvaro av mat (vi har sett att även döda bakterier signifikant minskar färgningseffektiviteten). Även om inkubationstiden är relativt kort är det möjligt att även inom denna tidsram kan homeostatiska svar förändras, inklusive mitofagi. Dessutom kan bindningen av färgämnena till ER / mitokondriella / nukleära proteiner och andra biomolekyler påverka aktiviteterna hos dessa organeller. Dessutom, till skillnad från mitofagimätning med genetiska sensorer, arbetar vi med maskar och celler som har genomgått kemisk fixering. Därför är det omöjligt att fortsätta övervaka samma maskar/celler vid olika tidpunkter. Därför rekommenderar vi att man kombinerar olika metoder för att validera mitofagiens funktion i en viss fysiologisk process. Nedan presenterar vi nya data som visar att VL-850 inducerar robust mitofagi i C. elegans-maskar och Hep-3B-celler. Därför stöder dessa data ytterligare hypotesen att VL-850 förlänger livslängden hos C. elegans och skyddar C. elegans från oxidativ skada genom induktion av frisk mitofagi . Vi har använt protonjonoforen karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon (FCCP), som är en potent mitofagiinducerare24, som en positiv kontroll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: För läsarnas bekvämlighet har vi delat upp protokollet i två delar: en fokuserar på protokollet för mätning av mitofagi i C. elegans, och den andra fokuserar på protokollet för mätning av mitofagi i leverceller. Listan över material finns i den bifogade materialförteckningen .

1. C. elegans-protokollet

  1. Beredning av NGM-plattorna (Nematode Growth Medium) och bakteriestammen Escherichia coli OP50
    OBS: Som en förtydligande punkt, medan vi följde standardprotokoll för beredning av NGM-plattorna och OP50 bakterielager25,26, inser vi att det kan finnas variationer i dessa protokoll mellan olika laboratorier. Därför har vi inkluderat de fullständiga protokollen för att säkerställa korrekt replikering av experimentet.
    1. Gör en 1 M kaliumfosfatbuffert, pH 6, genom att tillsätta ~ 150 ml 1 M K 2 HPO 4 till 500 ml 1 M KH2PO4 lösning tills pH 6 uppnås. Sterilisera bufferten genom att föra den genom ett 0,22 μm vakuumfilter/förvaringssystem.
    2. Gör 0,1 M kalciumklorid (CaCl2) och magnesiumsulfat (MgSO4) och sterilisera dem med ett 0,2 μm sprutfilter.
    3. Förbered 5 mg / ml kolesterol i absolut etanol.
      OBS: Eftersom kolesterolet framställs i etanol, filtrera det inte.
    4. Bered NGM-agar genom att lösa 1,5 g natriumklorid (NaCl), 1,25 g pepton och 8,5 g agar i 500 ml dubbeldestillerat vatten (DDW). Autoklav och låt svalna till ~ 55 ° C.
    5. Under sterila förhållanden tillsätt 12,5 ml kaliumfosfatbuffert (pH 6), 0,5 ml 0,1 MCaCl2, 0,5 ml 0,1 MMgSO4 och 1 ml 5 mg / ml kolesterol. Blanda väl efter varje tillsats.
    6. Tillsätt 4 ml smält NGM-agar till varje 35 mm platta. Låt disken stelna över natten (RT, ~ 21 ° C).
    7. För att göra Luria-Bertani (LB) agarplattor, lösa upp 5 g NaCl, 5 g trypton, 2,5 g jästextrakt och 7,5 g agar i 400 ml destillerat, avjoniserat vatten (DDW), justera lösningens pH till 7,0, bringa volymen upp till 500 ml med DDW och autoklav. När lösningen har svalnat till 55 °C, häll 25 ml av blandningen i varje 90 mm petriskål och låt plattorna torka i 2 dagar vid rumstemperatur. Därefter stryka ut OP50-bakterier på de torkade LB-plattorna från glycerolbeståndet och inkubera vid 37 ° C över natten för att få enstaka kolonier.
    8. Förbered 2x jästtrypton (YT) genom att lösa 8 g trypton, 5 g jästextrakt och 2,5 g natriumklorid (NaCl) i 0,5 liter DDW. Justera pH till 7 och autoklav.
    9. Vid kylning, inokulera en OP50-bakteriekoloni från den nystrimmiga LB-plattan i 50 ml 2x YT-medium i en 250 ml Erlenmeyerkolv. Skaka vid 37 °C och 250 rpm till en optisk densitet (OD600) på ca 0,6.
  2. Förberedelse av fordonet och experimentskyltar
    1. Tillsätt 100 μL OP50-bakterier till mitten av varje 35 mm NGM-agarplatta. Torka över natten vid rumstemperatur (rumstemperatur, 21 °C).
    2. Bered 0,5 M VL-850 i DMSO och späd till 10 mM VL-850 med M9-buffert (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 och 1 mM MgSO 4)26. Bekräfta att pH är 7,0 (om inte, titrera med 0,1 M HCl) och filtersterilisera lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter. Förbered fordonet enligt beskrivningen ovan, men utan läkemedlet (i detta fall VL-850). Gör 50 mM FCCP i DMSO, späd till 1 mM FCCP med M9-buffert och filtersterilisera lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter.
    3. Tillsätt 25 μL vehikel (negativ kontroll), FCCP (positiv kontroll; 5 μM) eller VL-850 (experimentell behandling; 62,5 μM) till separat sådda NGM-plattor på bakteriegräsmattan.
    4. Täck plattorna med aluminiumfolie och låt dem torka vid rumstemperatur (rumstemperatur, 21 °C). Använd plattorna efter ~ 16 timmar.
  3. Få synkroniserade unga vuxna C. elegans hermafroditer
    1. Gör 1 liter M9-buffert med 22 mM KH2PO 4, 42 mMNa2HPO4 och 86 mM NaCl. Sterilisera genom autoklav och låt det svalna. Efter kylning tillsätts 1 ml 1 mMMgSO4 (0,22 μm filtersteriliserad).
    2. Blanda 0,8 ml 2,5 N natriumhydroxid och 1 ml av en 5% lösning av natriumhypoklorit med 2,2 ml DDW för att skapa en 4 ml alkalisk hypokloritlösning (slutlig koncentration av 0,5 N för natriumhydroxid och 1,25% för natriumhypoklorit).
    3. Samla maskarna (dräktiga hermafroditer) i ett 15 ml koniskt rör genom att tvätta NGM-plattorna med 1 ml M9-buffert 3x för att säkerställa att alla mödrar har samlats in i röret.
    4. Sedimentera maskarna genom centrifugering vid 500 × g i 1 minut och kassera supernatanten tills en volym på 1 ml återstår.
    5. Tillsätt 1 ml alkalisk hypokloritlösning och blanda genom att invertera röret 5x. Virvla försiktigt röret i 3 minuter för att hjälpa till med frisättning av ägg och observera maskens tillstånd under ett dissekerande stereoskop.
    6. När cirka 50% av maskarna är trasiga, tillsätt 5 ml M9-buffert och sedimentera omedelbart äggen genom centrifugering i 1 min vid 500 × g.
    7. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. Tillsätt 5 ml M9-buffert och upprepa tvättproceduren 2x.
    8. Ta bort supernatanten tills 2 ml återstår och rotera röret (360 ° rotation) vid 20 rpm i ~ 16 h (RT, 21 ° C) för att få synkroniserade L1-larver. Från detta rör, ta en 5 μL droppe på en glasskiva, räkna antalet larver under ett stereoskop, upprepa detta steg 3x, ta ett genomsnitt av de tre räkningarna och uppskatta antalet maskar per mikroliter (μL). Baserat på dessa beräkningar, lägg till ~ 200 larver per NGM-platta sådd med OP50-bakterier.
    9. Odla L1-larverna vid 21 °C i ~48 timmar fram till den unga vuxna fasen.
  4. Läkemedelsbehandling och mikroskopiprocedur
    1. Sätt 100 maskar på var och en av experiment- eller kontrollplattorna. Se till att de negativa, positiva och experimentella plattorna innehåller vehikeln, 5 μM FCCP respektive 62,5 μM VL-850. Inkubera vid 21 °C i 6 timmar.
    2. Använd 1 ml M9-buffert för att tvätta maskarna från varje platta till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. Snurra röret kort (~ 3 s) i en minicentrifug. Kassera sedan supernatanten genom att pipettera ut M9-bufferten försiktigt utan att störa maskpelleten. Upprepa detta tvättsteg 2x och ta sedan försiktigt bort supernatanten utan att störa maskpelleten.
    3. Tillsätt 200 μL M9-buffert, som innehåller 0,1 % v/v Poloxamer 188, 0,1 % v/v Pluronic F127 och 2 μL av färgningssatsreagenset, till maskpelleten. Låt blandningen rotera vid 20 rpm (360 ° rotation) i 1 h vid rumstemperatur (rumstemperatur, 21 ° C). För att skydda färgämnena från ljus, täck rören med aluminiumfolie.
    4. Snurra maskarna försiktigt enligt beskrivningen i steg 1.3.4. Ta sedan bort färgningslösningen utan att störa maskpelleten. Tvätta sedan maskarna enligt beskrivningen i steg 1.3.2 och överför dem till en fröad NGM-agarplatta som innehåller lämplig behandling - till exempel överförs maskar behandlade med FCCP till en platta som innehåller FCCP. Täck plattorna med aluminiumfolie eftersom färgningsreagenset är ljuskänsligt.
      OBS: Vi överförde maskarna till odlingsplattor innehållande bakterier och motsvarande behandlingsmedel för att minimera bakgrundsbruset på grund av överskott av färgämne. Till exempel överfördes maskar som behandlats med FCCP till FCCP-kompletterade plattor och så vidare.
    5. Tvätta maskarna från plattorna i färska mikrocentrifugrör med 1 ml M9-buffert; Tvätta maskarna på samma sätt 2x. Fixa sedan maskarna med 1% formaldehyd på is i 30 minuter och tvätta maskarna med 1 ml M9-buffert 3x för att avlägsna kvarvarande formaldehyd. Efter tvättarna, snurra maskarna ner till en pellet och aspirera den maximala mängden supernatant, håll maskpelleten intakt i 10 μL M9.
    6. För att förbereda 2,5% agaros, väg 0,125 g agaros i ett 10 ml borosilikatglasprovrör, tillsätt 5 ml M9-buffert och lös agarosen genom att försiktigt värma röret med en Bunsen-brännare. Överför den smälta agarosen till ett torrt bad vid 75 °C och lägg med en 1 ml spets 100 μl av den smälta agarosen på ett Deckgläser-mikroskoptäckglas (24 mm x 60 mm). Lägg omedelbart en annan bild vinkelrätt på agarosdroppen och bilda en korsform. Vänta ~ 2 minuter och separera försiktigt glasen genom att (försiktigt) trycka på det övre täckglaset och därmed lämna agarosdynan på bottenlocket.
      OBS: Var försiktig när du värmer agarosen i röret och se till att röret hålls borta från kroppen. Skär kanten på 1 ml spetsen för att minimera koagulering av agarosen.
    7. Överför maskarna till agarosdynan med en Pasteur-glaspipett (dvs hela mängden i röret, ~ 10 μL). Ta bort överskottsvätskan med en veke gjord av en laboratorieduk och täck sedan maskarna med en mindre täckglas (24 mm x 40 mm). Applicera transparent nagellack i periferin av den mindre täckglaset för att förhindra avdunstning. Lägg bilden i en mörk låda för att skydda den från ljus.
    8. Använd ett konfokalmikroskop för att avbilda maskarna inom 24 timmar vid lämpliga våglängder (se nedan) med en 60x förstoringslins.
      1. Placera bilden på mikroskopsteget.
      2. Öppna bildhanteringsprogrammet och högerklicka på programvarans gråa område. Öppet förvärv | Ti2 Full Pad | ND Förvärv | LUT genom att klicka på alternativen i popup-fönstret som visas som ett resultat av högerklicket.
      3. Under Ti2 Full Pad väljer du 60x.
      4. Under Förvärv väljer du Okular DIA och sätter maskarna i fokus med hjälp av mikroskopets finfokusratt. Under Hämtning väljer du Snurrande disk och väljer alternativet 16-bitars - Ingen gruppering. För varje fluorescensfilter ställer du in exponeringstiden på 500 ms och 20 ms för Brightfield. När dessa parametrar har angetts väljer du Kör nu och väntar tills utdatabilden genereras som en ND2-fil.
        OBS: Exponeringstiden måste bestämmas experimentellt, eftersom olika bildinställningar har olika egenskaper. Använd uppslagstabeller (LUT) för att undersöka fluorescensintensiteten för varje våglängd.
  5. Bildanalys
    1. Öppna confocal bilder (här, Nikon ND2 filer) i ImageJ27 med colocalization plugin. Varje ND-fil innehåller bildplan tagna vid tre våglängder (med DAPI, GFP / FITC [grön] och Texas Red [röd] filter) och synligt ljus. Om du vill komma åt dessa bilder öppnar du ND-filen på ImageJ-servern och väljer Dela bilder i dialogrutan. Arbeta med ljusfält (BF), grön kanal och röda kanalbilder.
    2. Generera dubbletter av dessa bilder för att hålla originalbilden orörd genom att klicka på Bild | Duplicera eller använd kortkommandot Skift + D.
    3. För att minska bakgrunden, generera en annan kopia av bilden, som nämnts ovan. Subtrahera bakgrunden med en rullande radie på 100 och välj alternativet Skapa bakgrund (subtrahera inte) för att generera en bild med bakgrunden för den givna bilden. Gå sedan till Process | Bildkalkylator och subtrahera den första duplicerade bilden från den andra duplicerade bilden. Använd de resulterande bilderna för samlokaliseringsanalysen.
    4. Om du vill använda plugin-programmet för samlokalisering konverterar du bilderna för den gröna kanalen och den röda kanalen till 8-bitars. För att göra detta, klicka på Bild | Typ | 8 bitar.
    5. Klicka på Plugins | Samlokalisering. För att mäta samlokalisering av mitokondrier och lysosomsignaler med hjälp av colocalization plugin (se ovan), använd följande parametrar: Ratio = 75%, Threshold red channel = 80.0, Threshold green channel = 50.0. Utdata är en 8-bitars binär bild som innehåller colocalized puncta och en kombination av de tre 8-bitars bilderna (grön, röd och den samlokaliserade bilden) i en RGB-bild.
    6. Fokusera på puncta i maskens huvudkroppsväggsmuskel genom att manuellt välja detta område och skapa en mask genom att klicka på Redigera | Urval | Skapa mask, som väljer det intressanta området (bild 2A, B). Ta selektivt bort andra färgade enheter (t.ex. svalgmusklerna) för att analysera huvudkroppsväggens muskelregion.
    7. Om du vill välja partiklar i intresseområdet (ROI) väljer du de samlokaliserade 8-bitarsbilderna och maskerar bilderna med bildkalkylatorn. Använd sedan åtgärden AND (bild 3A) för att välja punktering i ROI. Detta genererar en bild med puncta i ROI (figur 3B).
    8. Om du vill analysera området för samlokaliserade mitokondrier och lysosomer väljer du Analysera | Analysera partiklar och mäta summeringen av puncta mellan 0,1625 μm 2 och 4 μm2.

2. Hep-3B-cancercellprotokollet

  1. Beredning av läkemedelsstamlösningen
    1. Förbered 100 mM VL-850 i DMSO. Späd den till 5 mM med 0,5 M HEPES-buffert, pH 7,3, och sterilisera lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter. Förbered sedan fordonet som beskrivits tidigare, men utan läkemedlet (i detta fall VL-850).
  2. Odling av Hep-3B-celler för experiment, läkemedelsbehandling och mikroskopiprocedur
    1. Odla Hep-3B-celler i 10 cm vävnadsodlingsplattor innehållande Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2% L-glutamin och 1% tetracyklin (nedan kallat komplett DMEM). Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 %CO2.
    2. Välj en platta med Hep-3B-celler som visar 70% -80% cellsammanflöde (logaritmisk tillväxtfas), ta bort mediet och tvätta plattan med 5 ml förvärmd fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS och inkubera cellerna med 1 ml förvärmt 0,25% trypsin / 0,02% EDTA i ~ 3 minuter vid 37 ° C; Observera cellerna under ett vävnadsodlingsmikroskop (10x). Stoppa trypsinsmältningen när cellerna blir runda och börja dissociera från plattan genom att tillsätta 5 ml komplett DMEM. Centrifugera cellerna vid 1 000 × g i 5 minuter, avlägsna supernatanten och suspendera cellerna igen i 5 ml komplett DMEM.
    3. Bestäm cellkoncentrationen. Blanda 50 μl av cellsuspensionen med 50 μl trypanblått. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare eller genom att använda en hemocytometer 5x och ta ett genomsnitt av dessa räkningar för att säkerställa räkningarnas noggrannhet.
    4. Frö 42 000 Hep3G-celler i varje 8-brunns μ-slide i 400 μL komplett DMEM (som beskrivits ovan). Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C och 5 %CO2.
    5. Efter 24 timmar vid ~80–85 % sammanflöde, avlägsna 250 μl medium från var och en av brunnarna och tillsätt 50 μl medium med lämplig behandling eller vehikel. För att följa detta protokoll, behandla cellerna med 100 μM VL-850, 5 μM FCCP och ett fordon som en kontroll.
    6. Efter 6 timmars inkubation med föreningarna tillsätts 50 μl medium till varje brunn som innehåller färgningsreagenset (0,5 μL färgämne för 250 μL i varje brunn). Inkubera cellerna med färgämnet i 30 minuter vid 37 °C och 5 %CO2.
      OBS: Eftersom färgningsreagenset är ljuskänsligt, minimera exponeringen för ljus genom att täcka proverna med aluminiumfolie och arbeta i en miljö med svagt ljus (om möjligt).
    7. Använd en 200 μL pipett, ta försiktigt bort allt medium (250 μL) från varje brunn och tvätta sedan cellerna med 200 μL förvärmd PBS.
    8. Fixera cellerna med 200 μL fixeringslösning innehållande 4% formaldehyd och 2,5% glutaraldehyd beredd i PBS i 15 minuter vid RT.
    9. Häll av fixeringslösningen och tvätta kort med 200 μl PBS.
    10. Tillsätt 200 μL PBS, håll cellerna täckta och skyddade från ljus vid 4 °C och avbilda inom 24 timmar.
      OBS: Vi använde spinnskivans konfokalmikroskop i fyra kanaler, inklusive DIC, TRITC, FITC och DAPI, som i steg 1.4.8. Vi avbildade ~ 300 celler per behandling.
  3. Bildanalys
    1. Utför steg 1.5.1-1.5.5. För att få avkastningen på cellerna, generera en bild som markerar cellområdet. Välj en bild med samlokaliserade punkter (RGB) (bild 4A). Om du vill markera hela cellområdet väljer du Process | Binär | Skapa mask för att få en binär bild (bild 4B). Om du vill analysera cellens område väljer du Analysera | Analysera partiklar och mät alla partiklar i bilden från 0 till oändlighet, vilket är standardinställningen för Analysera partiklar.
    2. För att analysera området för de samlokaliserade mitokondrierna och lysosomerna, välj en samlokaliserad 8-bitars bild, konvertera den till binär genom att välja välj Process | Binär | Gör binär, välj Analysera | Analysera partiklar och mäta summeringen av puncta mellan 0,1625 μm 2 och 4 μm2. För att mäta den samlokaliserade puncta, dela området för de samlokaliserade mitokondrierna och lysosomerna med den totala cellytan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion av ett robust mitofagisvar i både C. elegans-maskar och Hep-3B-celler med VL-850
VL-850 skyddar C. elegans maskar och humana keratinocyter (HaCaT-celler) från oxidativ stress23. För att ytterligare undersöka dess verkningsmekanism undersökte vi om VL-850 inducerar mitofagi i C. elegans och andra humana celler. För att testa detta exponerade vi C. elegans-maskar (unga vuxna, 3 dagar efter L1) till 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (positiv kontroll) och vehikel (negativ kontroll) i 6 timmar. Som beskrivits ovan mätte vi mitofagi med färgningsreagenset. Vi valde att använda koncentrationen 62,5 μM för VL-850 eftersom det skyddar maskarna från oxidativ stress och avsevärt förlänger deras livslängd23. VL-850 inducerade robust mitofagi i maskarnas huvudkroppsväggsmuskler (figur 5), vilket indikerar att det är en potent mitofagiinducerare. Observera att mitofagistyrkan hos VL850 liknade den för FCCP (figur 5).

Dessutom utförde vi ett liknande experiment med Hep-3B-celler; Denna cellinje härstammar från en 8-årig svart man med primärt hepatocellulärt karcinom (HCC)28. I likhet med C. elegans-experimentet exponerade vi cellerna för 100 μM VL-850, 5 μM FCCP (positiv kontroll) och vehikel (negativ kontroll) i 6 timmar och använde färgningsreagenset för att kvantifiera mitofagi. VL-850 och FCCP inducerade signifikant mitofagi (i liknande utsträckning) i Hep-3B-cellerna (figur 6), vilket ytterligare stöder vår hypotes att VL-850 är en potent mitofagiinducerare i både C. elegans och humana celler.

Figure 1
Figur 1: Mitophagy mätning i C. elegans och Hep-3B celler. Schematisk ritning som illustrerar användningen av färgningssatsen för att mäta mitofagi i både C. elegans-maskar och levercancerceller. Förkortningar: VL-850 = O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin); FCCP = karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon, PBS = fosfatbuffrad saltlösning; NGM = nematod tillväxtmedium. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Val av huvud-kroppsvägg muskelregion av intresse i C. elegans. (A) Området av intresse väljs manuellt och en mask genereras. (B) Den resulterande maskbilden visar huvudområdet av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kvantifiering av den samlokaliserade puncta i en region av intresse i C. elegans. (A) För att välja punktpunkt i det berörda området måste operationen "OCH" väljas. (B) Den resulterande bilden visar punkteringen i det intressanta området. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Markera celler i ett område av intresse . (A) En bild av samlokaliserade punkter (RGB) genereras efter samlokaliseringsfunktionen. (B) En maskbild som representerar hela cellområdet där puncta ska studeras. Förkortning: RGB = röd, grön och blå. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Induktion av robust mitofagi i C. elegans med VL-850. (A) Pilspetsarna visar samlokalisering av mitokondrier och lysosomer som ett exempel på representativ samlokalisering. Insatsen, som har en åttafaldig förstoring, tillhandahålls för bättre visualisering. Skalstänger = 100 μm. (B) Samlokaliseringen kvantifierades med tre biologiska upprepningar och 30 maskar per behandling. Signifikansen av resultaten bestämdes genom att jämföra dem med fordonskontrollerna, och asteriskerna indikerar statistisk signifikans. Statistisk analys utfördes med hjälp av en oparad enkelriktad ANOVA (Brown-Forsythe och Welch ANOVA-test med Welchs korrigering), och ett p-värde på mindre än 0,0001 (****p < 0,0001) ansågs statistiskt signifikant. Förkortning: FCCP = karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: VL-850 inducerar signifikant mitofagi i Hep-3B-celler . (A) Pilspetsarna visar samlokaliseringen av mitokondrier och lysosomer för att representera samlokaliseringen, och en insats ingår för att demonstrera samlokaliseringen vid åttafaldig förstoring. Skalstreck = 25 μm. (B) Samlokaliseringen kvantifierades med tre biologiska upprepningar och N ≥ 411 celler per behandling (411 faller inom det intervall som möjliggör statistisk signifikans och förtroende för resultaten). Statistiskt signifikanta skillnader bedömdes jämfört med fordonskontrollerna, och asteriskerna indikerar signifikans. Data analyserades med hjälp av en oparad enkelriktad ANOVA (Brown-Forsythe och Welch ANOVA-test med Welchs korrigering) och ett p-värde på mindre än 0,0001 (****p < 0,0001) ansågs vara statistiskt signifikant. Förkortning: FCCP = karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera mitofagivägar involverar olika proteiner och biomolekyler (t.ex. kardiolipin29). Slutpunkten för dessa vägar är dock liknande - nedbrytningen av mitokondrier av lysosomala enzymer12,13. Faktum är att flera metoder använder denna slutpunkt för att kvantifiera mitofagi. Vissa metoder, såsom elektronmikroskopi, kräver dock tillgång till dyr utrustning, utbildade experter och en förlängd förberedelsetid för proverna och analysen. Trots fördelarna med att använda mitofagibiosensorer, som inkluderar mätning av mitofagi i specifika vävnader / celler / subcellulära fack, kan uttrycket av sådana sensorer förändra cellensfysiologi 21. Därför finns det ett behov av en tillförlitlig, kostnadseffektiv och snabb metod för att kvantifiera mitofagi utan behov av långvarig interferens med normal cellfysiologi.

Här beskriver vi en sådan metod, som innebär användning av en prisvärd kommersiell blandning av mitokondrier / lysosom / kärnfärgcocktail. Vi demonstrerade nyligen dess användbarhet vid mätning av mitofagi i C. elegans och odödliga humana keratinocyter (HaCaT-celler)23. Färgningssatsresultaten validerades med två biosensorer, inklusive mito-Rosella (i C. elegans) och cox8-mCherry-EGFP (i humana SH-SY5Y-neuroblastomceller), samt qPCR-experiment som kvantifierade förhållandet mellan mitokondriellt och nukleärt DNA-innehåll och uttrycket av flera mitofagi / autofagigener23.

I denna studie utvidgade vi vår forskning för att utforska den mitofagiaktiverande styrkan hos VL-850 i C. elegans-maskar och humant leveradenokarcinom Hep-3B-celler. Resultaten visar att VL-850 är en potent mitofagiinducerare (Figur 5 och Figur 6). Dessa resultat stöder ytterligare de tidigare observationerna att VL-850 skyddar C. elegans från oxidativ stress och förlänger deras livslängd, samt inducerar mitofagi i HaCat-celler23.

Trots användbarheten av färgningssatsen har den vissa begränsningar med avseende på C. elegans-studier. För det första, åtminstone under de studerade förhållandena, observerade vi inte färgning av dendriter och axoner. Därför är det nuvarande protokollet inte användbart för att mäta mitofagi i dessa neuronala enheter. För det andra kan intestinal autofluorescens störa den gröna fluorescenssignalen från mitokondriellt färgämne. Därför bör försiktighet iakttas vid tillämpning av denna metod för mitofagimätningar i tarmen. Slutligen, och särskilt i samband med humana / gnagare cellinjer, kan lysosomfärgen fläcka sura enheter i kärnan. Därför rekommenderas empirisk titrering av färgningsreagenskoncentrationen/inkubationstiden för varje cellinje/medium-sammansättning.

Dessutom, som föreslagits ovan, är ingen enda metod tillräcklig för att visa mitofagi. Därför rekommenderar vi validering av färgningsreagensresultaten med alternativa metoder (t.ex. mitofagibiosensorer, qPCR, immunfärgning) och inkluderar alltid en positiv mitofagikontroll (t.ex. FCCP). Sammanfattningsvis ger färgningsreagensfärgcocktailen en pålitlig och kostnadseffektiv metod för kvantifiering av mitofagi i C. elegans och humana celler. Med tanke på den signifikanta skillnaden mellan humana och C. elegans-celler förväntar vi oss att denna metod lätt kan anpassas till andra djursystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i Gross-laboratoriet för den kritiska läsningen av manuskriptet och deras kommentarer och råd. Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), för att tillhandahålla några av stammarna. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Vitalunga Ltd och Israel Science Foundation (bidrag nr 989/19). Den grafiska abstrakta figuren (figur 1) genererades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent or resource
Analytical balance Mettler-Toledo
Bacto Agar BD-Difco 214010
Bacto Peptone BD-Difco 211677
Bacto Tryptone BD-Difco 211705
Bacto Yeast extract BD-Difco 212750
Calcium chloride Sigma C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Chemicals
Cholestrol Thermo Fisher C/5360/48
DMEM high glucose Biological Industries 01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
FBS heat inactivated Invitrogen M7514
Gluteradehyde (25%) Sigma G5882
HEPES Buffer 1 M Biological Industries 03-025-1B
L-gluatamine Biological Industries 03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent Abcam ab139487
Magnesium Sulfate Sigma M7506
Nonidet P 40 Sigma 74385
Paraformalydehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15720
Poloxamer 188 Solution Sigma P5556
Potassium dihydrogen phosphate Millipore 1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride Bio-Lab 1903059100
Sodium Hydroxide Gadot 1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate Sigma 4273
Tetracycline hydrochloride Sigma 87128-25G
Trypsin-EDTA Biological Industries 03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter Millex GV SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates Corning 430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB15-500
35 mm Petri dishes Bar Naor BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm Lifegene LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm Marienfeld 101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass Pyrex 99445-13
iBiDi 8 well μ-slides iBiDi 80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm Bar Naor BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire World Precision Instruments PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF DeNovix CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400 Biosan BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software Nikon CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope Olympus SZ61
pH meter Mettler-Toledo MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator Labnet H5600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  26. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Tags

Biologi utgåva 195 Mitophagy mitokondriell autofagi lysosom Caenorhabditis elegans Hep-3B-celler
Detektion av mitofagi i <em>Caenorhabditis elegans och däggdjursceller</em> med användning av organellspecifika färgämnen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, V., Gross, E. Detection… More

Srivastava, V., Gross, E. Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes. J. Vis. Exp. (195), e65337, doi:10.3791/65337 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter