Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

مزامنة النيماتود: طريقة للحصول على مجموعات من الديدان في مراحل مماثلة من التنمية

Overview

في هذا الفيديو ، نعرض طريقة لإنتاج مجموعة متزامنة تنمويا من البالغين العقيمين C. elegans. بروتوكول المثال مزامنة الديدان لدراسة معدلات استهلاك الأكسجين في الحيوانات الحية.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من سارازيا ونورمان، قياس معدلات استهلاك الأكسجين في Elegans Caenorhabditis سليمة، J. Vis. Exp. (2019).

1. نمو ومزامنة السكان النيماتودا

ستصل هذه الحيوانات إلى مرحلة يرقات L4 بعد ~ 42 ساعة. في هذا الوقت ، قم بنقل يرقات L4 باستخدام اختيار بلاتينيوم إلى لوحات NGM المصنفة OP50 التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل 5 -fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) لمنعها من إنتاج ذرية.
ملاحظة: تأكد من مزامنة جميع السلالات ضمن التجربة لفترة زمنية مماثلة. علاج FUdR يعقم الحيوانات ويمنع وضع البيض وإنتاج ذرية، والتي يمكن أن تؤثر على OCR. سيتم تحليل هذه الحيوانات المعقمة في اليوم التالي (اليوم 1 الحيوانات البالغة في ~ 66 ساعة) للمقاهة. وقد أفيد FUdR للتأثير على علم وظائف الأعضاء وعمر بعض الديدان المتحولة. لذلك ، يجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند استخدام الدواء للتعقيم. ويمكن أيضا تعقيم الديدان عن طريق تأنيث الطفرات مثل fem-1 (hc17) أو fem-3 (e2006). ومع ذلك، قد تؤثر هذه الطفرات على وظيفة الميتوكوندريا.

  1. نقل يرقات L4 من الخلفيات الوراثية المرغوبة (على سبيل المثال، N2 [نوع البرية] وسل-12 الحيوانات) على وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) لوحات (انظر الجدول 1 لوصفة) البذور الطازجة مع حديقة من الإشريكية القولونية (OP50). استخدام ما لا يقل عن اثنين من 100 ملم أو ثلاث لوحات 60 ملم لكل سلالة. احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسبة (بين 15-25 درجة مئوية) لمدة 3-4 أيام أو حتى تتركز لوحات مع عدد كبير من البيض والديدان gravid.
  2. غسل البيض والديدان قبالة لوحات باستخدام ما يقرب من 6 مل من العازلة M9 (انظر الجدول 1 لوصفة) لكل لوحة 100 ملم من الديدان الخيطية ونقلها مع ماصة باستور الزجاج في أنابيب الطرد المركزي 15 مل الفردية لكل سلالة. تدور هذه الأنابيب إلى أسفل لمدة 3 دقائق في 6180 × ز واستنشق من العازلة M9، والاحتفاظ فقط الحيوانات والبيض بيليه.
  3. إضافة 3-4 مل من محلول التبييض (انظر الجدول 1 لوصفة) إلى كل أنبوب ودوامة متقطعة لمدة 6 دقائق. إضافة M9 العازلة لملء كل أنبوب وتدور في 6180 × ز لمدة 1 دقيقة وspirate supernatant. كرر هذا الغسيل مع M9 ثلاث مرات ونقل بيليه البيض إلى أنبوب 15 مل الطازجة التي تحتوي على ما يقرب من 9 مل من العازلة M9.
  4. مزامنة الديدان الطازجة عن طريق nutating في 20 درجة مئوية لمدة 16-48 ساعة. تدور هذه الأنابيب إلى أسفل في 6,180 × ز لمدة 1.5 دقيقة ووضع الحيوانات L1 متزامنة أسفل على لوحات NGM الفردية المبذرة حديثا مع حديقة OP50 (حوالي 6,000-10,000 الحيوانات لكل لوحة 100 ملم) والحفاظ على 20 درجة مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجدول 1: وصفات لوحات NGM، المخزن المؤقت M9، ومحلول التبييض.

المخزن المؤقت M9 (1 لتر)
dH2O 1000 مل
ناكل 5 جم
KH2PO4 3 جم
Na2HPO4 6 جم
1 م ملغسو4 1 مل * إضافة بعد الالاستعباد التلقائي
تقسيم بين 2 زجاجات: 500 مل لكل منهما. الأوتوكلاف على دورة السائل (15 دقيقة التعرض)
محلول التبييض (50 مل)
dH2O 36 مل
بيض 14 مل
10 ن ناوه 800 ميكرولتر
لوحات قياسية لنمو النيماتودا (NGM) 1 لتر 0.5 لتر 0.25 لتر
ناكل 3 جم 1.5 غرام 0.75 غرام
باكو أغار 17 غرام 8.5 غرام 4.25 غرام
باكتو بيبتون 2.5 غرام 1.25 غرام 0.625 غرام
أ. الأوتوكلاف على دورة السائل (45 دقيقة التعرض),
السماح لتبرد إلى ~ 60 درجة مئوية ومن ثم استخدام تقنية معقمة وإضافة ما يلي:
1 لتر 0.5 لتر 0.25 لتر
1 م كاك 2 1 مل 0.5 مل 0.25 مل
1 م ملغسو4 1 مل 0.5 مل 0.25 مل
1 M كيلوبو4 25 مل 12.5 مل 6.25 مل
5 ملغم/مل كوليسترول 1 مل 0.5 مل 0.25 مل
(ب) 2005 دوامة لخلط جيدا بعد كل إضافة. بعد إجراء جميع الإضافات، صب لوحات

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm; 60 mm Petri dishes Kord-Valmark Labware Products 2900; 2901
15 mL conical tubes Corning 430791
50 mL conical tubes Corning 430829
Agar Fisher Scientific BP1423-2
Bacto peptone BD; Bacto 211677
Bacto tryptone BD; Bacto 211705
Bacto yeast extract BD; Bacto 212705
Bleach Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Fisher Scientific C79-500
Cholesterol Fisher Scientific C314-500
Deionized water (dH2O)
Glass Pasteur pipettes Krackeler Scientific 6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) Fisher Scientific BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

مزامنة النيماتود: طريقة للحصول على مجموعات من الديدان في مراحل مماثلة من التنمية
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST

المصدر: سارازيا، س. ونورمان، ك. ر. قياس معدلات استهلاك الأكسجين في Elegans Caenorhabditis سليمةج. فيس إكسب. (2019).

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter