Overview
在这段视频中，我们展示了一种产生无菌成年 C.elegans发育同步种群的方法。示例协议同步蠕虫来研究活体动物的耗氧率。
Protocol
该协议是萨拉西亚和诺曼的摘录，测量氧气消耗率在无菌卡诺哈布迪蒂斯埃莱甘斯 ，J.维斯Exp。(2019).
1. 线虫种群的增长和同步
这些动物将在~42小时后到达L4幼虫阶段。此时，使用铂金采摘将 L4 幼虫移到 OP50 种子 NGM 板中，其中含有 0.5 毫克/mL 5-氟-2'-脱氧尿素 （FUdR），以防止它们产生后代。
注释 确保在实验中，所有菌株都同步了类似的时间。FUDR 治疗对动物进行灭菌，防止产卵和后代生产，这可能会影响 OCR。这些绝育动物将在第二天（第1天成人动物在~66小时）进行分析。据报道，FUdR会影响某些突变蠕虫的生理和寿命。因此，当药物用于灭菌时，应考虑到这一点。蠕虫也可以通过女性化突变（如女性-1（hc17）或女性-3（e2006）来绝育。然而，这些突变可能会影响线粒体功能。
- 将所需遗传背景的 L4 幼虫（如 N2 [野生类型] 和 sel-12 动物） 转移到线虫生长介质 （NGM） 板 （见食谱表 1）新鲜播种与大肠杆菌（OP50） 的草坪。每个菌株至少使用两个 100 mm 或三个 60 mm 板。在适当的生长温度（15~25°C之间）孵化蠕虫3~4天，或直到盘子中含有大量的卵子和大块蠕虫。
- 使用每100毫米板线虫大约 6 毫升的 M9 缓冲器（见表 1 的配方）清洗盘子中的鸡蛋和蠕虫，并用玻璃巴氏杆菌移液器将它们转移到每个菌株的单独 15 mL 离心管中。在 6，180 x g 下旋转这些管子 3 分钟，吸气出 M9 缓冲器，仅保留动物和鸡蛋颗粒。
- 在每个管子中加入 3–4 mL 的漂白溶液（参见配方表 1），间歇性涡流 6 分钟。 添加 M9 缓冲器以填充每个管子，并在 6，180 x g 处旋转 1 分钟，然后吸气超自然。用 M9 重复此洗涤三次，并将蛋丸移到含有约 9 mL M9 缓冲器的新鲜 15 mL 管中。
- 通过在 20 °C 的 16–48 h 中螺母同步新孵化的蠕虫。将这些管子以 6，180 x g 的速度旋转 1.5 分钟，并将同步的 L1 动物放在单独的 NGM 板上，这些 NGM 板新播种的草坪为 OP50（每 100 mm 板约 6，000×10，000 只动物），并保持在 20 °C。
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Representative Results
表1：NGM板、M9缓冲区和漂白剂溶液的配方。
| M9 缓冲区 （1 L） | |||
| dH2O | 1，000毫升 | ||
| 纳克 | 5 克 | ||
| KH2PO4 | 1 % | ||
| 纳2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M 毫克SO4 | 1 mL*自动切割后添加 | ||
| 分成2瓶：每瓶500毫升。液体循环上的高压灭菌（15分钟曝光） | |||
| 漂白溶液 （50 mL） | |||
| dH2O | 36升 | ||
| 漂白 | 14升 | ||
| 10 N纳赫 | 800μL | ||
| 标准线虫生长介质 （NGM） 板 | 0 米 | 0.5 升 | 0.25 L |
| 纳克 | 1 % | 1.5 克 | 0.75 克 |
| 巴托-阿加 | 17 g | 8.5 克 | 4.25 克 |
| 巴托-佩普通 | 2.5 克 | 1.25 克 | 0.625 克 |
| 一。液体循环高压灭菌（45分钟曝光）， 允许冷却至~60°C，然后使用无菌技术并添加以下： |
|||
| 0 米 | 0.5 升 | 0.25 L | |
| 1 M 卡克莱尔 2 | 1升 | 0.5升 | 0.25毫升 |
| 1 M 毫克SO4 | 1升 | 0.5升 | 0.25毫升 |
| 1 M KPO4 | 25升 | 12.5升 | 6.25毫升 |
| 5毫克/mL胆固醇 | 1升 | 0.5升 | 0.25毫升 |
| 乙。每次添加后旋转以彻底混合。所有添加后，倒盘 |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
