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Encyclopedia of Experiments

Nematode-Synchronisation: Eine Methode, um Populationen von Würmern in identischen Entwicklungsstadien zu erhalten

Overview

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur Herstellung einer entwicklungssynchronisierten Population steriler erwachsener C. elegans. Das Beispielprotokoll synchronisiert Würmer, um die Sauerstoffverbrauchsraten bei lebenden Tieren zu untersuchen.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Sarasija und Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Wachstum und Synchronisation der Nematodenpopulation

Diese Tiere erreichen das L4-Larvenstadium nach 42 h. Zu diesem Zeitpunkt bewegen Sie die L4-Larven mit einem Platinpickel auf OP50-saatierte NGM-Platten, die 0,5 mg/ml 5-Fluor-2'-Deoxyuridin (FUdR) enthalten, um sie an der Produktion von Nachkommen zu hindern.
ANMERKUNG Stellen Sie sicher, dass innerhalb eines Experiments alle Stämme für einen ähnlichen Zeitraum synchronisiert werden. Die FUdR-Behandlung sterilisiert die Tiere und verhindert eiablage- und nachkommend, was OCR beeinflussen könnte. Diese sterilisierten Tiere werden am nächsten Tag (Tag 1 erwachsene Tiere bei 66 h) für den Test analysiert. Es wurde berichtet, dass FUdR die Physiologie und Lebensdauer bestimmter mutierter Würmer beeinflusst. Daher sollte dies berücksichtigt werden, wenn das Medikament für die Sterilisation verwendet wird. Würmer können auch durch feminisierende Mutationen wie fem-1(hc17) oder fem-3(e2006) sterilisiert werden. Diese Mutationen könnten sich jedoch auf die mitochondriale Funktion auswirken.

  1. L4-Larven der gewünschten genetischen Hintergründe (z. B. N2 [Wildtyp] und Sel-12-Tiere) auf Nematoden-Wachstumsmedienplatten (nGM) (siehe Tabelle 1 für Rezept) frisch mit einem Rasen von Escherichia coli (OP50) ausgesät. Verwenden Sie mindestens zwei 100 mm oder drei 60 mm Platten für jede Dehnung. Inkubieren Sie die Würmer bei der entsprechenden Wachstumstemperatur (zwischen 15–25 °C) für 3–4 Tage oder bis die Platten mit einer großen Anzahl von Eiern und Gravidwürmern konzentriert sind.
  2. Die Eier und Würmer mit ca. 6 ml M9-Puffer (siehe Tabelle 1 für Rezept) pro 100 mm Nematodenplatte von den Tellern waschen und mit Glaspasteurpipetten in einzelne 15 ml Zentrifugenrohre für jeden Stamm übertragen. Drehen Sie diese Röhren 3 min bei 6.180 x g nach unten und aspirieren Sie den M9-Puffer heraus, wodurch nur die Tiere und das Eierpellet erhalten bleiben.
  3. Fügen Sie 3–4 ml Bleichlösung (siehe Tabelle 1 für Rezept) zu jedem Rohr und intermittierend Wirbel für 6 min. Fügen Sie M9 Puffer, um jedes Rohr zu füllen und drehen bei 6.180 x g für 1 min und Aspirat Überstand. Wiederholen Sie diese Wäsche mit M9 dreimal und bewegen Sie das Eipellet in ein frisches 15 ml Rohr mit ca. 9 ml M9 Puffer.
  4. Synchronisieren Sie die frisch geschlüpften Würmer, indem Sie bei 20 °C für 16–48 h nisch. Drehen Sie diese Rohre 1,5 min bei 6.180 x g nach unten und legen Sie die synchronisierten L1-Tiere auf einzelne NGM-Platten, frisch gesät mit einem Rasen von OP50 (ca. 6.000–10.000 Tiere pro 100 mm Platte) ab und halten Sie bei 20 °C.

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Representative Results

Tabelle 1: Rezepte für NGM-Platten, M9-Puffer und Bleichlösung.

M9-Puffer (1 L)
dH2O 1.000 ml
Nacl 5 g
KH2PO4 3 g
Na2HPO4 6 g
1 M MgSO4 1 ml *nach dem Autoklavieren hinzufügen
Aufgeteilt auf 2 Flaschen: je 500 ml. Autoklav im Flüssigkeitszyklus (15 min Exposition)
Bleichlösung (50 ml)
dH2O 36 ml
Bleichmittel 14 ml
10 N NaOH 800 l
Standard Nematode Growth Media (NGM) Platten 1 L 0,5 L 0,25 L
Nacl 3 g 1,5 g 0,75 g
Bacto-agar 17 g 8,5 g 4,25 g
Bacto-Pepton 2,5 g 1,25 g 0,625 g
Eine. Autoklav im Flüssigkeitszyklus (45 min Exposition),
auf 60 °C abkühlen lassen und dann sterile Technik verwenden und Folgendes hinzufügen:
1 L 0,5 L 0,25 L
1 M CaCl2 1 ml 0,5 ml 0,25 ml
1 M MgSO4 1 ml 0,5 ml 0,25 ml
1 M KPO4 25 ml 12,5 ml 6,25 ml
5 mg/ml Cholesterin 1 ml 0,5 ml 0,25 ml
B. Wirbeln, um gründlich nach jeder Zugabe zu mischen. Nachdem alle Ergänzungen gemacht sind, gießen Sie Platten

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm; 60 mm Petri dishes Kord-Valmark Labware Products 2900; 2901
15 mL conical tubes Corning 430791
50 mL conical tubes Corning 430829
Agar Fisher Scientific BP1423-2
Bacto peptone BD; Bacto 211677
Bacto tryptone BD; Bacto 211705
Bacto yeast extract BD; Bacto 212705
Bleach Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Fisher Scientific C79-500
Cholesterol Fisher Scientific C314-500
Deionized water (dH2O)
Glass Pasteur pipettes Krackeler Scientific 6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) Fisher Scientific BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-1

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Quelle: Sarasija, S. und Norman, K. R. Messung der Sauerstoffverbrauchsraten in Intact Caenorhabditis elegansJ. Vis. (2019).

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