Overview
В этом видео мы показываем метод производства развития синхронизированной популяции стерильных взрослых C. elegans. Пример протокола синхронизирует червей для изучения показателей потребления кислорода у живых животных.
Protocol
Этот протокол является выдержкой из Sarasija и Норман, Измерение потребления кислорода ставки в Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Рост и синхронизация популяции нематод
Эти животные достигнут стадии личинок L4 после 42 ч. В это время, переместить личинки L4 с помощью платины забрать OP50 семенами NGM пластин, содержащих 0,5 мг / мл 5-фтор-2'-дезиуридин (FUdR), чтобы предотвратить их от производства потомства.
ПРИМЕЧАНИЕ Убедитесь, что в рамках эксперимента все штаммы синхронизируются в течение аналогичного периода времени. Обработка FUdR стерилизовывает животных и предотвращает кладку яиц и производство потомства, что может повлиять на OCR. Эти стерилизованные животные будут проанализированы на следующий день (день 1 взрослых животных на 66 ч) для анализа. Сообщается, что FUdR влияет на физиологию и продолжительность жизни некоторых червей-мутантов. Поэтому, это должно быть принято во внимание, когда препарат используется для стерилизации. Черви также могут быть стерилизованы с помощью феминизации мутаций, таких как fem-1(hc17) или fem-3(e2006). Однако эти мутации могут повлиять на митохондриальную функцию.
- Передача личинок L4 желаемого генетического происхождения (например, N2 (дикий тип) и сель-12 животных) на пластины нематодного роста (NGM) (см. таблицу 1 для рецепта) только что посеянные с газоном кишечной палочки (OP50). Используйте по крайней мере две 100 мм или три 60 мм пластин для каждого штамма. Инкубировать червей при соответствующей температуре роста (между 15-25 градусов по Цельсию) в течение 3-4 дней или до тех пор, пока пластины сосредоточены с большим количеством яиц и гравийных червей.
- Вымойте яйца и червей с пластин, используя примерно 6 мл буфера M9 (см. таблицу 1 для рецепта) на 100 мм пластины нематод и передать их со стеклянными пипетками Пастера в отдельные 15 мл центрифуг трубки для каждого штамма. Спин эти трубы вниз в течение 3 мин на 6180 х г и аспирировать из буфера M9, сохраняя только животных и яйца гранулы.
- Добавьте 3-4 мл раствора отбеливателя (см. таблицу 1 для рецепта) к каждой трубке и периодически вихрь в течение 6 мин. Добавить M9 буфер для заполнения каждой трубки и спина на 6180 х г в течение 1 мин и аспирата supernatant. Повторите эту стирку с M9 три раза и переместить яичные гранулы на свежие 15 мл трубки, содержащей около 9 мл буфера M9.
- Синхронизировать свежевылупившихся червей, опоясывания при 20 градусов по Цельсию для 16-48 ч. Спин эти трубки вниз на 6180 х г в течение 1,5 мин и положить синхронизированных L1 животных вниз на отдельных ngM пластины свежесеянные с газоном OP50 (примерно 6000-10000 животных на 100 мм пластины) и держать на 20 градусов по Цельсию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Таблица 1: Рецепты ngM пластин, буфер M9, и отбеливатель решения.
| Буфер M9 (1 Л) | |||
| dH2O | 1000 мл | ||
| NaCl | 5 г | ||
| KH2PO4 | 3 г | ||
| Na2HPO4 | 6 г | ||
| 1 М МгСО4 | 1 мл й добавить после автоклавинга | ||
| Разделите между 2 бутылками: по 500 мл каждая. Автоклав на жидком цикле (15 мин воздействия) | |||
| Решение отбеливателя (50 мл) | |||
| dH2O | 36 мл | ||
| отбеливать | 14 мл | ||
| 10 N NaOH | 800 мкл | ||
| Стандартные пластины Nematode Growth Media (NGM) | 1 л | 0,5 л | 0,25 л |
| NaCl | 3 г | 1,5 г | 0,75 г |
| Бакто-агар | 17 г | 8,5 г | 4,25 г |
| Бакто-пептон | 2,5 г | 1,25 г | 0,625 г |
| ля. Автоклав на жидком цикле (45 мин воздействия), дать остыть до 60 градусов по Цельсию, а затем использовать стерильную технику и добавить следующее: |
|||
| 1 л | 0,5 л | 0,25 л | |
| 1 M CaCl2 | 1 мл | 0,5 мл | 0,25 мл |
| 1 М МгСО4 | 1 мл | 0,5 мл | 0,25 мл |
| 1 M KPO4 | 25 мл | 12,5 мл | 6,25 мл |
| 5 мг/мл холестерина | 1 мл | 0,5 мл | 0,25 мл |
| си. Закружить тщательно перемешать после каждого добавления. После того, как все дополнения сделаны, залить пластины |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
