Overview
Neste vídeo, mostramos um método de produção de uma população sincronizada de desenvolvimento de adultos estéreis C. elegans. O protocolo de exemplo sincroniza os vermes para estudar as taxas de consumo de oxigênio em animais vivos.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Sarasija e Norman, Medição das Taxas de Consumo de Oxigênio em Cavímite Intacta elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Crescimento e sincronização da população de nematoides
Esses animais chegarão ao estágio larval L4 após ~42 h. Neste momento, mova as larvas L4 usando uma picareta de platina para placas de NGM semeadas OP50 contendo 0,5 mg/mL 5-fluoro-2'-desoxyuridina (FUdR) para impedi-las de produzir prole.
NOTA Certifique-se de que dentro de um experimento todas as cepas estão sincronizadas por uma quantidade semelhante de tempo. O tratamento com FUdR esteriliza os animais e previne a colocação de ovos e a produção de progêneres, o que pode influenciar o OCR. Esses animais esterilizados serão analisados no dia seguinte (dia 1 animais adultos a ~66 h) para o ensaio. FUdR foi relatado para impactar a fisiologia e a vida útil de certos vermes mutantes. Portanto, isso deve ser levado em consideração quando a droga é usada para esterilização. Os vermes também podem ser esterilizados por meio de mutações feminizantes como fem-1(hc17) ou fem-3(e2006). No entanto, essas mutações podem afetar a função mitocondrial.
- Transfira larvas L4 de origens genéticas desejadas (por exemplo, N2 [tipo selvagem] e animais sel-12) em placas de mídia de crescimento de nematoides (NGM) (ver Tabela 1 para receita) recém-semeadas com um gramado de Escherichia coli (OP50). Use pelo menos duas placas de 100 mm ou três de 60 mm para cada cepa. Incubar os vermes na temperatura de crescimento apropriada (entre 15-25 °C) durante 3-4 dias ou até que as placas estejam concentradas com um grande número de ovos e vermes gravid.
- Lave os ovos e os vermes das placas usando aproximadamente 6 mL de tampão M9 (ver Tabela 1 para receita) por placa de 100 mm de nematoides e transfira-os com pipetas pasteur de vidro em tubos de centrífugas individuais de 15 mL para cada cepa. Gire estes tubos para baixo por 3 min a 6.180 x g e aspire o tampão M9, retendo apenas os animais e pelotas de ovos.
- Adicione 3-4 mL de solução de alvejante (ver Tabela 1 para receita) a cada tubo e vórtice intermitente por 6 min. Adicione tampão M9 para encher cada tubo e gire a 6.180 x g por 1 min e aspirar supernanato. Repita esta lavagem com M9 três vezes e mova a pelota de ovo para um tubo fresco de 15 mL contendo aproximadamente 9 mL de tampão M9.
- Sincronize os vermes recém-eclodidos por nozes a 20 °C por 16-48 h. Gire esses tubos a 6.180 x g por 1,5 min e coloque os animais L1 sincronizados em placas individuais de NGM recém-semeadas com um gramado de OP50 (aproximadamente 6.000-10.000 animais por placa de 100 mm) e mantenha-se a 20 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabela 1: Receitas para placas de NGM, tampão M9 e solução de alvejante.
| Tampão M9 (1 L) | |||
| dH2O | 1.000 mL | ||
| NaCl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 7 F | ||
| 1 M MGSO4 | 1 mL *adicionar após autoclaving | ||
| Divida entre 2 garrafas: 500 mL cada. Autoclave no ciclo líquido (15 min de exposição) | |||
| Solução alvejante (50 mL) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| branquear | 14 mL | ||
| 10 N Naoh | 800 μL | ||
| Placas padrão de Mídia de Crescimento de Nematode (NGM) | 0 m | 0,5 L | 0.25 L |
| NaCl | 3 g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-ágar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-peptone | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| um. Autoclave no ciclo líquido (exposição de 45 min), deixe esfriar a ~60 °C e, em seguida, use técnica estéril e adicione o seguinte: |
|||
| 0 m | 0,5 L | 0.25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M MGSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| Colesterol de 5 mg/mL | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| B. Redemoinho para misturar completamente após cada adição. Depois de todas as adições são feitas, despeje placas |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
