Overview
Dans cette vidéo, nous montrons une méthode de production d’une population synchronisée sur le plan du développement de C. elegans adulte stérile. Le protocole d’exemple synchronise les vers pour étudier les taux de consommation d’oxygène chez les animaux vivants.
Protocol
Ce protocole est un extrait de Sarasija et Norman, Mesure des taux de consommation d’oxygène dans Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Croissance et synchronisation de la population de nématodes
Ces animaux atteindront le stade larvaire L4 après ~42 h. À cette époque, déplacez les larves de L4 à l’aide d’un pic de platine vers les plaques de NGM ensemencées OP50 contenant 0,5 mg/mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) pour les empêcher de produire de la descendance.
NOTE (EN) Assurez-vous que, dans le cadre d’une expérience, toutes les souches sont synchronisées pendant un temps similaire. Le traitement FUdR stérilise les animaux et empêche la ponte et la production de descendance, ce qui pourrait influencer l’OCR. Ces animaux stérilisés seront analysés le lendemain (jour 1 des animaux adultes à ~66 h) pour l’analyse. FUdR a été signalé pour avoir un impact sur la physiologie et la durée de vie de certains vers mutants. Par conséquent, cela doit être pris en considération lorsque le médicament est utilisé pour la stérilisation. Les vers peuvent également être stérilisés au moyen de mutations féminisantes telles que fem-1 (hc17) ou fem-3(e2006). Cependant, ces mutations pourraient avoir un impact sur la fonction mitochondrique.
- Transférer les larves L4 des milieux génétiques désirés (p. ex., N2 [type sauvage] et sel-12 animaux) sur des plaques de milieux de croissance des nématodes (NGM) (voir le tableau 1 pour la recette) fraîchement ensemencées avec une pelouse d’Escherichia coli (OP50). Utilisez au moins deux plaques de 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche. Incuber les vers à la température de croissance appropriée (entre 15-25 °C) pendant 3-4 jours ou jusqu’à ce que les plaques soient concentrées avec un grand nombre d’œufs et de vers gravids.
- Lavez les œufs et les vers des assiettes à l’aide d’environ 6 mL de tampon M9 (voir le tableau 1 pour la recette) par plaque de nématodes de 100 mm et transférez-les avec des pipettes Pasteur en verre dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 mL pour chaque souche. Faites tourner ces tubes vers le bas pendant 3 min à 6 180 x g et aspirez le tampon M9, en conservant seulement les animaux et les boulettes d’oeufs.
- Ajouter 3 à 4 mL de solution d’eau de Javel (voir le tableau 1 pour la recette) à chaque tube et vortex intermittent pendant 6 min. Ajouter le tampon M9 pour remplir chaque tube et tourner à 6 180 x g pendant 1 min et aspirer le supernatant. Répétez ce lavage avec M9 trois fois et déplacez la pastille d’œuf dans un tube frais de 15 mL contenant environ 9 mL de tampon M9.
- Synchronisez les vers fraîchement éclos en les nutant à 20 °C pendant 16 à 48 h. Faites tourner ces tubes à 6 180 x g pendant 1,5 min et placez les animaux synchronisés L1 sur des plaques NGM individuelles fraîchement ensemencées avec une pelouse d’OP50 (environ 6 000 à 10 000 animaux par plaque de 100 mm) et maintenez-les à 20 °C.
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Representative Results
Tableau 1 : Recettes de plaques NGM, tampon M9 et solution d’eau de Javel.
| Tampon M9 (1 L) | |||
| dH2O (en) | 1 000 mL | ||
| NaCl (NaCl) | 5 g | ||
| KH2PO4 (KH2PO4) | 1 % | ||
| Na2HPO4 Na2HPO4 | 4 % | ||
| 1 M mgSO4 | 1 mL *ajouter après l’autoclaving | ||
| Divisé en 2 bouteilles : 500 mL chacune. Autoclave sur cycle liquide (exposition de 15 min) | |||
| Solution bleach (50 mL) | |||
| dH2O (en) | 36 mL | ||
| blanchir | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 μL | ||
| Plaques Standard Nematode Growth Media (NGM) | 1 L | 0,5 L | 0,25 L |
| NaCl (NaCl) | 1 % | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-peptone | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| un. Autoclave sur cycle liquide (exposition de 45 min), laisser refroidir à ~60 °C, puis utiliser une technique stérile et ajouter ce qui suit : |
|||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M mgSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| 5 mg/mL de cholestérol | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| B. Tourbillonner pour bien mélanger après chaque ajout. Après que tous les ajouts soient faits, versez des plaques |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
