Overview
Bu videoda, steril yetişkin C. eleganlarıngelişimsel olarak senkronize edilmiş bir popülasyonu üretme yöntemini gösteriyoruz. Örnek protokol, canlı hayvanlarda oksijen tüketim oranlarını incelemek için solucanları senkronize eder.
Protocol
Bu protokol Sarasija ve Norman'dan bir alıntıdır, Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp'deOksijen Tüketim Oranlarının Ölçümü . (2019).
1. Nematod popülasyonunun büyümesi ve senkronizasyonu
Bu hayvanlar ~ 42 saat sonra L4 larva aşamasına ulaşacaktır. Şu anda, L4 larvalarını platin bir toplama kullanarak, soy üretmelerini önlemek için 0,5 mg / mL 5-floro-2'-deoksidrin (FUdR) içeren OP50 tohumlu NGM plakalarına taşıyın.
NOT Bir denemede tüm suşların benzer bir süre için eşitlendiğinden emin olun. FUdR tedavisi hayvanları sterilize eder ve OCR'yi etkileyebilecek yumurtlama ve soy üretimini önler. Bu sterilize edilmiş hayvanlar ertesi gün (gün ~ 66 saat'te 1 yetişkin hayvan) test için analiz edilecektir. FUdR'nin bazı mutant solucanların fizyolojisini ve ömrünü etkilediği bildirilmiştir. Bu nedenle, ilaç sterilizasyon için kullanıldığında bu dikkate alınmalıdır. Solucanlar ayrıca fem-1(hc17) veya fem-3 (e2006) gibi kadınsı mutasyonlar yoluyla sterilize edilebilir. Bununla birlikte, bu mutasyonlar mitokondriyal işlevi etkileyebilir.
- İstenen genetik geçmişlerin (örneğin, N2 [vahşi tip] ve sel-12 hayvanları) L4 larvalarını nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarına aktarın (tarif için Tablo 1'e bakınız) Escherichia coli (OP50) çimleri ile taze tohumlanmıştır. Her suş için en az iki adet 100 mm veya üç adet 60 mm plaka kullanın. Solucanları uygun büyüme sıcaklığında (15-25 ° C arasında) 3-4 gün boyunca veya plakalar çok sayıda yumurta ve gravid solucanı ile konsantre olana kadar kuluçkaya yatırın.
- Yumurtaları ve solucanları, 100 mm'lik nematod tabağı başına yaklaşık 6 mL M9 tamponu (tarif için Tablo 1'e bakın) kullanarak tabaklardan yıkayın ve cam Pasteur pipetlerle her suş için ayrı 15 mL santrifüj tüplerine aktarın. Bu tüpleri 6.180 x g'da 3 dakika aşağı çevirin ve M9 tamponu aspire ederek sadece hayvanları ve yumurta peletini tutun.
- Her tüpe 3-4 mL çamaşır suyu çözeltisi ekleyin (tarif için Tablo 1'e bakın) ve 6 dakika boyunca aralıklı girdap ekleyin. Her tüpü doldurmak için M9 tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca 6.180 x g'da döndürün ve süpernatantı aspire edin. Bu yıkamayı M9 ile üç kez tekrarlayın ve yumurta peletini yaklaşık 9 mL M9 tampon içeren taze bir 15 mL tüpe taşıyın.
- Yeni yumurtadan çıkan solucanları 20 °C'de 16-48 saat fındıklayarak senkronize edin. Bu tüpleri 1,5 dakika boyunca 6,180 x g'da aşağı çevirin ve senkronize edilmiş L1 hayvanlarını OP50 çimi (100 mm plaka başına yaklaşık 6.000-10.000 hayvan) ile taze tohumlanmış bireysel NGM plakalarına koyun ve 20 °C'de tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1: NGM tabakları, M9 tamponu ve çamaşır suyu çözeltisi tarifleri.
| M9 arabelleği (1 L) | |||
| dH2O | 1.000 mL | ||
| Nacl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL *otomatik kapanmadan sonra ekle | ||
| 2 şişe arasında bölün: her biri 500 mL. Sıvı döngüsünde otoklav (15 dk pozlama) | |||
| Çamaşır suyu çözeltisi (50 mL) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| Çamaşır suyu | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 μL | ||
| Standart Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları | 1 L | 0,5 L | 0,25 L |
| Nacl | 3g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-pepton | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| A. Sıvı döngüsünde otoklav (45 dk maruz kalma), ~60 °C'ye kadar soğumaya bırakın ve ardından steril tekniği kullanın ve aşağıdakileri ekleyin: |
|||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| 5 mg/mL kolesterol | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| B. Her eklemeden sonra iyice karıştırmak için döndürün. Tüm eklemeler yapıldıktan sonra, tabakları dökün |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
