Overview
このビデオでは、生殖不能成虫 C.エレガンスの発達的に同期した集団を生産する方法を示す。このプロトコルの例では、ワームを同期させて、生きている動物の酸素消費量を調べています。
Protocol
このプロトコルは、サラシヤとノーマンからの抜粋です, 無傷のカエノルハブディティスエレガンスの酸素消費量率の測定,J. Vis. Exp.(2019).
1. 線虫集団の成長と同期
これらの動物は、〜42時間後にL4幼虫段階に達する。このとき、白金ピックを使用してL4幼虫を0.5 mg/mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine(FUdR)を含むOP50播種NGMプレートに移動し、子孫を産生するのを防ぎます。
注 実験の中で、すべての株が同じ時間だけ同期されていることを確認します。FUdR治療は、動物を殺菌し、OCRに影響を与える可能性のある産卵および子孫の生産を防ぎます。これらの殺菌された動物は、翌日(1日目の成虫動物〜66時間)をアッセイのために分析する。FUdRは、特定の変異型ワームの生理学および寿命に影響を与えると報告されている。したがって、これは、薬剤が殺菌のために使用される際に考慮されるべきです。ワームは、フェム-1(hc17)やフェム3(e2006)などの突然変異を女性化することによっても殺菌することができます。しかし、これらの突然変異はミトコンドリア機能に影響を与える可能性があります。
- 所望の遺伝的背景(例えば、N2[野生型]およびセル-12動物)のL4幼虫を線虫増殖培地(NGM)プレートに移す(レシピについては表1参照)、大腸菌(OP50)の芝生で播種した。各株に少なくとも2つの100 mmまたは3つの60 mmプレートを使用してください。3~4日間、または大量の卵と肉虫でプレートが濃縮されるまで、適切な成長温度(15~25°C)でワームをインキュベートします。
- ネマトデの100 mmプレートあたり約6mLのM9バッファ(レシピについては表1を参照)を使用してプレートから卵とワームを洗い流し、ガラス製パスツールピペットを各株の個々の15 mL遠心管に移します。これらのチューブを6,180 x gで3分間回転させ、M9バッファーを吸引し、動物と卵ペレットだけを保持します。
- 各チューブに3〜4 mLの漂白剤溶液(レシピについては表1を参照)を加え、6分間断続的に渦を加え、M9バッファーを加えて、各チューブを充填し、6,180 x gで1分間回転し、1分間、吸気上清を吸引します。M9で3回洗浄を繰り返し、約9mLのM9バッファーを含む新鮮な15mLチューブに卵ペレットを移動します。
- 20°Cで16〜48時間の間に、孵化したてのワームを同期させます。これらのチューブを6,180 x gで1.5分間回転させ、OP50(100mmプレートあたり約6,000~10,000匹)の芝生で播種した個々のNGMプレートに同期L1動物を置き、20°Cに保ちます。
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Representative Results
表1:NGMプレート、M9バッファー、および漂白剤溶液のレシピ。
| M9 バッファ (1 L) | |||
| dH2O | 1,000 mL | ||
| ナクル | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| ナ2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL *オートクレーブ後に追加 | ||
| 2本のボトルに分ける:各500 mL。液体サイクルのオートクレーブ(15分露光) | |||
| 漂白剤溶液(50 mL) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| ブリーチ | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 μL | ||
| 標準線虫増殖培地(NGM)プレート | 1 L | 0.5 L | 0.25 L |
| ナクル | 3 g | 1.5グラム | 0.75グラム |
| バクト寒天 | 17 g | 8.5グラム | 4.25グラム |
| バクトペプトン | 2.5グラム | 1.25グラム | 0.625 g |
| a.液体サイクル(45分露光)のオートクレーブ、 〜60 °Cに冷却し、滅菌技術を使用し、次を追加することができます。 |
|||
| 1 L | 0.5 L | 0.25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0.5 mL | 0.25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0.5 mL | 0.25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12.5 mL | 6.25 mL |
| 5 mg/mL コレステロール | 1 mL | 0.5 mL | 0.25 mL |
| ロ。各追加後に完全に混合するために渦巻く。すべての追加が行われた後、プレートを注ぎます |
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
