Overview
בסרטון זה, אנו מראים שיטה לייצר אוכלוסייה מסונכרנת מבחינה התפתחותית של מבוגר סטרילי C. elegans. פרוטוקול הדוגמה מסנכרן תולעים כדי לחקור את שיעורי צריכת החמצן בבעלי חיים חיים.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Sarasija ונורמן, מדידה של שיעורי צריכת חמצן ב אלגנים Caenorhabditis שלם, J. Vis. Exp. (2019).
1. צמיחה וסנכרון של אוכלוסיית נמטודה
בעלי חיים אלה יגיעו לשלב הזחל L4 לאחר ~ 42 שעות. בשלב זה, להזיז את הזחלים L4 באמצעות לבחור פלטינה OP50 זרעים NGM צלחות המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל 5-פלואורו-2'-deoxyuridine (FUdR) כדי למנוע מהם לייצר צאצאים.
שים לב ודא כי בתוך ניסוי כל הזנים מסונכרנים במשך כמות דומה של זמן. טיפול FUdR מעקר את בעלי החיים ומונע הטלת ביצים וייצור צאצאים, מה שעלול להשפיע על זיהוי תווים אופטי (OCR). בעלי חיים מעוקרים אלה ינותח למחרת (יום 1 בעלי חיים בוגרים ב ~ 66 שעות) לבדיקה. FUdR דווח להשפיע על פיזיולוגיה ותוחלת חיים של תולעים מוטנטים מסוימים. לכן, יש לקחת זאת בחשבון כאשר התרופה משמשת לחיטוי. תולעים יכולות גם להיות מעוקרות באמצעות מוטציות נשיות כגון fem-1(hc17) או fem-3(e2006). עם זאת, מוטציות אלה עשויות להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה.
- העבר זחלי L4 מרקעים גנטיים רצויים (למשל, N2 [סוג פראי] ו sel-12 בעלי חיים) על מדיה צמיחה נמטודה (NGM) צלחות (ראה טבלה 1 למתכון) זרע טרי עם מדשאה של Escherichia coli (OP50). השתמש לפחות שני 100 מ"מ או שלושה צלחות 60 מ"מ עבור כל זן. דגירה התולעים בטמפרטורת הצמיחה המתאימה (בין 15 °C (15 °F) במשך 3-4 ימים או עד צלחות מרוכזים עם מספר גדול של ביצים תולעים gravid.
- לשטוף את הביצים והתולעים את הצלחות באמצעות כ 6 מ"ל של חיץ M9 (ראה טבלה 1 למתכון) לכל צלחת 100 מ"מ של nematodes ולהעביר אותם עם זכוכית פיפטות פסטר לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מ"ל עבור כל זן. לסובב את הצינורות האלה למטה במשך 3 דקות ב 6,180 x g ולשאוף את חיץ M9, שמירה רק את בעלי החיים ואת הביצים גלולה.
- הוסף 3-4 מ"ל של פתרון אקונומיקה (ראה טבלה 1 למתכון) לכל צינור ומערבולת לסירוגין במשך 6 דקות. חזור על שטיפה זו עם M9 שלוש פעמים ולהעביר את גלולת הביצה לצינור טרי 15 מ"ל המכיל כ 9 מ"ל של חיץ M9.
- סנכרנו את התולעים הטריות על ידי אגוזים ב-20°C למשך 16-48 שעות. לסובב את הצינורות האלה למטה ב 6,180 x g במשך 1.5 דקות ולשים את בעלי החיים L1 מסונכרן למטה על לוחות NGM בודדים טרי זרעים עם מדשאה של OP50 (כ 6,000-10,000 בעלי חיים לכל צלחת 100 מ"מ) ולשמור על 20 °C (60 °F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טבלה 1: מתכונים לצלחות NGM, חיץ M9 ותמיסת אקונומיקה.
| מאגר M9 (1 L) | |||
| dH2O | 1,000 מ"ל | ||
| נקלה (נקל) | 5 גר' | ||
| KH2PO4 | 3g | ||
| Na2HPO4 | 6 גר' | ||
| 1 M MgSO4 | 1 מ"ל * להוסיף לאחר autoclaving | ||
| לפצל בין 2 בקבוקים: 500 מ"ל כל אחד. אוטוקלאב על מחזור נוזלי (חשיפה של 15 דקות) | |||
| תמיסת אקונומיקה (50 מ"ל) | |||
| dH2O | 36 מ"ל | ||
| אקונומיקה | 14 מ"ל | ||
| 10 N נאוה | 800 μL | ||
| לוחות מדיה סטנדרטית לצמיחה נמטודה (NGM) | 1 ליטר | 0.5 ליטר | 0.25 ליטר |
| נקלה (נקל) | 3g | 1.5 גרם | 0.75 גרם |
| בקטו אגר | 17 גר' | 8.5 גר' | 4.25 גרם |
| בקטו-פפטון | 2.5 גרם | 1.25 גרם | 0.625 גרם |
| ת. אוטוקלאב על מחזור נוזלי (חשיפה של 45 דקות), לאפשר להתקרר ~ 60 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשתמש בטכניקה סטרילית ולהוסיף את הדברים הבאים: |
|||
| 1 ליטר | 0.5 ליטר | 0.25 ליטר | |
| 1 M CaCl2 | 1 מ"ל | 0.5 מ"ל | 0.25 מ"ל |
| 1 M MgSO4 | 1 מ"ל | 0.5 מ"ל | 0.25 מ"ל |
| 1 M KPO4 | 25 מ"ל | 12.5 מ"ל | 6.25 מ"ל |
| 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול | 1 מ"ל | 0.5 מ"ל | 0.25 מ"ל |
| ב. מערבולת לערבב ביסודיות לאחר כל תוספת. לאחר כל התוספות נעשות, יוצקים צלחות |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
