Overview
In deze video laten we een methode zien om een ontwikkelingsgesynchronleerde populatie steriele volwassen C. elegans teproduceren. Het voorbeeldprotocol synchroniseert wormen om zuurstofverbruik bij levende dieren te bestuderen.
Protocol
Dit protocol is een uittreksel uit Sarasija en Norman, Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Groei en synchronisatie van nematodenpopulatie
Deze dieren bereiken het L4 larvale stadium na ~42 uur. Verplaats op dit moment de L4-larven met behulp van een platinapriem naar OP50 gezaaide NGM-platen met 0,5 mg/ml 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) om te voorkomen dat ze nakomelingen produceren.
OPMERKING Zorg ervoor dat binnen een experiment alle stammen gedurende een vergelijkbare tijd worden gesynchroniseerd. FUdR-behandeling steriliseert de dieren en voorkomt het leggen van eieren en de productie van nakomelingen, wat OCR kan beïnvloeden. Deze gesteriliseerde dieren worden de volgende dag (dag 1 volwassen dieren om ~66 uur) geanalyseerd voor de test. FUdR heeft naar verluidt invloed op de fysiologie en levensduur van bepaalde gemuteerde wormen. Daarom moet hiermee rekening worden gehouden wanneer het medicijn wordt gebruikt voor sterilisatie. Wormen kunnen ook gesteriliseerd worden door middel van feminizing mutaties zoals fem-1(hc17) of fem-3(e2006). Deze mutaties kunnen echter van invloed zijn op de mitochondriale functie.
- Breng L4-larven met de gewenste genetische achtergronden (bijv. N2 [wild type] en sel-12 dieren) over op nematodengroeimedia (NGM) platen (zie tabel 1 voor recept) vers gezaaid met een gazon van Escherichia coli (OP50). Gebruik ten minste twee platen van 100 mm of drie platen van 60 mm voor elke soort. Incubeer de wormen bij de juiste groeitemperatuur (tussen 15-25 °C) gedurende 3-4 dagen of totdat de platen zijn geconcentreerd met een groot aantal eieren en gravidwormen.
- Was de eieren en wormen van de platen met ongeveer 6 ml M9 buffer (zie tabel 1 voor recept) per 100 mm bord nematoden en breng ze over met glazen Pasteur pipetten in individuele 15 ml centrifugebuizen voor elke soort. Draai deze buizen 3 minuten naar beneden op 6.180 x g en aspireer de M9-buffer, waarbij alleen de dieren en de eierenkorrel behouden blijven.
- Voeg 3-4 ml bleekoplossing (zie tabel 1 voor recept) toe aan elke buis en draai met tussenpozen gedurende 6 minuten. Voeg M9-buffer toe om elke buis te vullen en draai gedurende 1 minuut op 6.180 x g en aspireer supernatant. Herhaal deze was drie keer met M9 en verplaats de eierkorrel naar een verse buis van 15 ml met ongeveer 9 ml M9-buffer.
- Synchroniseer de vers uitgebroede wormen door gedurende 16-48 uur bij 20 °C te noteren. Draai deze buizen gedurende 1,5 min op 6.180 x g en leg de gesynchroniseerde L1-dieren neer op individuele NGM-platen die vers zijn gezaaid met een gazon van OP50 (ongeveer 6.000-10.000 dieren per plaat van 100 mm) en houd ze op 20 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1: Recepten voor NGM-platen, M9-buffer en bleekoplossing.
| M9 buffer (1 L) | |||
| dH2O | 1.000 ml | ||
| Nacl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 ml * toevoegen na autoclaaf | ||
| Verdeeld over 2 flessen: elk 500 ml. Autoclaaf op vloeistofcyclus (15 min blootstelling) | |||
| Bleekmiddeloplossing (50 ml) | |||
| dH2O | 36 ml | ||
| Bleekmiddel | 14 ml | ||
| 10 N NaOH | 800 μL | ||
| Standaard Nematode Growth Media (NGM) platen | 1 L | 0,5 L | 0,25 L |
| Nacl | 3 g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-pepton | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| A. Autoclaaf op vloeistofcyclus (45 min blootstelling), laat afkoelen tot ~60 °C en gebruik vervolgens steriele techniek en voeg het volgende toe: |
|||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| 1 M MgSO4 | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| 1 M KPO4 | 25 ml | 12,5 ml | 6,25 ml |
| 5 mg/ml cholesterol | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| B. Wervel om na elke toevoeging grondig te mengen. Nadat alle toevoegingen zijn gemaakt, giet platen |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
