Overview
I denne video viser vi en metode til at producere en udviklingssynkront synkroniseret befolkning af sterile voksne C. elegans. Eksempelprotokollen synkroniserer orme for at studere iltforbrugshastigheder hos levende dyr.
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Sarasija og Norman, Måling af iltforbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Vækst og synkronisering af nematodebestanden
Disse dyr vil nå L4 larvestadiet efter ~ 42 timer. På dette tidspunkt skal du flytte L4 larverne ved hjælp af en platin pick til OP50 seedede NGM plader, der indeholder 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-deoxyuridin (FUdR) for at forhindre dem i at producere afkom.
BEMÆRK! Sørg for, at alle stammer synkroniseres i et eksperiment i et tilsvarende tidsrum. FUdR-behandling steriliserer dyrene og forhindrer æglægning og afkomproduktion, hvilket kan påvirke OCR. Disse steriliserede dyr vil blive analyseret den næste dag (dag 1 voksne dyr på ~ 66 h) for analysen. FUdR er blevet rapporteret til at påvirke fysiologi og levetiden for visse mutant orme. Derfor bør dette tages i betragtning, når lægemidlet anvendes til sterilisering. Orme kan også steriliseres ved hjælp af feminizing mutationer såsom fem-1 (hc17) eller fem-3 (e2006). Disse mutationer kan dog påvirke mitokondriefunktionen.
- L4 larver af ønskede genetiske baggrunde (f.eks. N2 [vilde dyr] og sel-12 dyr) overføres til nematode vækstmedier (NGM) plader (se tabel 1 for opskrift) frisksået med en græsplæne på Escherichia coli (OP50). Der anvendes mindst to 100 mm eller tre 60 mm plader for hver stamme. Ormene inkuberes ved den passende væksttemperatur (mellem 15 og 25 °C) i 3-4 dage, eller indtil pladerne er koncentreret med et stort antal æg og gravid orme.
- Æggene og ormene vaskes af pladerne med ca. 6 mL M9 buffer (se tabel 1 for opskrift) pr. 100 mm plade nematoder og overføres med glas Pasteur pipetter til individuelle 15 mL centrifugerør for hver stamme. Spin disse rør ned i 3 min ved 6.180 x g og aspirere ud M9 buffer, bevarer kun dyr og æg pellet.
- Der tilsættes 3-4 ml blegemiddelopløsning (se tabel 1 for opskrift) til hvert rør og periodisk hvirvelstrøm i 6 min. Tilsæt M9 buffer til at fylde hvert rør og spin på 6.180 x g i 1 min. og aspirat supernatant. Gentag denne vask med M9 tre gange og flyt æggepillen til et frisk 15 mL rør, der indeholder ca. 9 mL M9 buffer.
- Synkroniser de nyklækkede orme ved at møtrikere ved 20 °C i 16-48 timer. Disse rør skal drejes ned med 6.180 x g i 1,5 min. og sættes de synkroniserede L1-dyr ned på individuelle NGM-plader, der er frisksået med en græsplæne på OP50 (ca. 6.000-10.000 dyr pr. 100 mm plade) og holdes ved 20 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1: Opskrifter på NGM-plader, M9-buffer og blegemiddelopløsning.
| M9-buffer (1 L) | |||
| dH2O | 1.000 mL | ||
| Nacl | 5 g | ||
| KH2PO4 | 3 g | ||
| Na2HPO4 | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 mL *tilføj efter autoklavering | ||
| Delt mellem 2 flasker: 500 mL hver. Autoklave om flydende cyklus (15 min eksponering) | |||
| Blegemiddelopløsning (50 ml) | |||
| dH2O | 36 mL | ||
| Blegemiddel | 14 mL | ||
| 10 N NaOH | 800 μL | ||
| Standard Nematode Growth Media (NGM) plader | 1 L | 0,5 L | 0,25 L |
| Nacl | 3 g | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-peptone | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| A. Autoklave på flydende cyklus (45 min eksponering), lad det køle af til ~60 °C og derefter bruge steril teknik og tilsæt følgende: |
|||
| 1 L | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M MgSO4 | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| 1 M KPO4 | 25 mL | 12,5 mL | 6,25 mL |
| 5 mg/mL kolesterol | 1 mL | 0,5 mL | 0,25 mL |
| B. Hvirvel for at blande grundigt efter hver tilsætning. Når alle tilføjelser er lavet, hæld plader |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
