Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Nematodesynkronisering: En metode for å få populasjoner av ormer i identiske utviklingsstadier

Overview

I denne videoen viser vi en metode for å produsere en utviklingssynkronisert befolkning av steril voksen C. elegans. Eksempelprotokollen synkroniserer ormer for å studere oksygenforbruk i levende dyr.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Sarasija og Norman, Måling av oksygenforbruk i intakt caenorhabditt elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Vekst og synkronisering av nematodepopulasjon

Disse dyrene vil nå L4 larvalstadiet etter ~ 42 timer. På dette tidspunktet flytter du L4-larvene ved hjelp av en platinaplukking til OP50 frø NGM-plater som inneholder 0,5 mg / ml 5-fluoro-2'-deoksyuridin (FUdR) for å forhindre at de produserer avkom.
MERKNAD Forsikre deg om at i et eksperiment synkroniseres alle stammer i en lignende tidsperiode. FUdR-behandling steriliserer dyrene og forhindrer egglegging og avkomproduksjon, noe som kan påvirke OCR. Disse steriliserte dyrene vil bli analysert neste dag (dag 1 voksne dyr ved ~ 66 timer) for analysen. FUdR har blitt rapportert å påvirke fysiologi og levetid for visse mutant ormer. Derfor bør dette tas i betraktning når stoffet brukes til sterilisering. Ormer kan også steriliseres ved hjelp av feminiserende mutasjoner som fem-1(hc17) eller fem-3 (e2006). Disse mutasjonene kan imidlertid påvirke mitokondriefunksjonen.

  1. Overfør L4 larver av ønsket genetisk bakgrunn (f.eks. N2 [vill type] og sel-12 dyr) på nematode vekstmedier (NGM) plater (se tabell 1 for oppskrift) fersk frø med en plen av Escherichia coli (OP50). Bruk minst to 100 mm eller tre 60 mm plater for hver strekk. Inkuber ormene ved riktig veksttemperatur (mellom 15-25 °C) i 3-4 dager eller til platene er konsentrert med et stort antall egg og gravid ormer.
  2. Vask eggene og ormene av platene ved hjelp av ca. 6 ml M9 buffer (se tabell 1 for oppskrift) per 100 mm tallerken nematoder og overfør dem med glass Pasteur pipetter til individuelle 15 ml sentrifugerør for hver stamme. Spinn disse rørene ned i 3 min ved 6180 x g og aspirer ut M9-bufferen, og behold bare dyrene og eggpellet.
  3. Tilsett 3–4 ml blekemiddeloppløsning (se tabell 1 for oppskrift) i hvert rør og periodisk virvel i 6 min. Tilsett M9-buffer for å fylle hvert rør og spinn på 6180 x g i 1 min og aspirer supernatant. Gjenta denne vasken med M9 tre ganger og flytt eggpellet til et friskt 15 ml rør som inneholder ca. 9 ml M9 buffer.
  4. Synkroniser de nyutviklede ormene ved å muttere ved 20 °C i 16–48 timer. Spinn disse rørene ned på 6,180 x g i 1,5 min og legg de synkroniserte L1-dyrene ned på individuelle NGM-plater ferskt frø med en plen på OP50 (ca. 6000-10.000 dyr per 100 mm plate) og hold på 20 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabell 1: Oppskrifter på NGM-plater, M9-buffer og blekemiddelløsning.

M9-buffer (1 L)
dH2O 1000 ml
Nacl 5 g
KH2PO4 3 g
Na2HPO4 6 g
1 M MgSO4 1 ml * legg til etter autoklavering
Splitt mellom 2 flasker: 500 ml hver. Autoklav på væskesyklus (15 min eksponering)
Blekemiddeloppløsning (50 ml)
dH2O 36 ml
Blekemiddel 14 ml
10 N NaOH 800 μL
Standard Nematode Growth Media(NGM)-plater 1 L 0,5 L 0,25 L
Nacl 3 g 1,5 g 0,75 g
Bacto-agar 17 g 8,5 g 4,25 g
Bacto-peptone 2,5 g 1,25 g 0,625 g
A. Autoklav på væskesyklus (45 min eksponering),
avkjøles til ~60 °C og bruk deretter steril teknikk og legg til følgende:
1 L 0,5 L 0,25 L
1 M CaCl2 1 ml 0,5 ml 0,25 ml
1 M MgSO4 1 ml 0,5 ml 0,25 ml
1 M KPO4 25 ml 12,5 ml 6,25 ml
5 mg / ml kolesterol 1 ml 0,5 ml 0,25 ml
B. Virvle for å blande grundig etter hvert tillegg. Etter at alle tillegg er laget, hell plater

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm; 60 mm Petri dishes Kord-Valmark Labware Products 2900; 2901
15 mL conical tubes Corning 430791
50 mL conical tubes Corning 430829
Agar Fisher Scientific BP1423-2
Bacto peptone BD; Bacto 211677
Bacto tryptone BD; Bacto 211705
Bacto yeast extract BD; Bacto 212705
Bleach Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Fisher Scientific C79-500
Cholesterol Fisher Scientific C314-500
Deionized water (dH2O)
Glass Pasteur pipettes Krackeler Scientific 6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) Fisher Scientific BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Nematodesynkronisering: En metode for å få populasjoner av ormer i identiske utviklingsstadier
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Kilde: Sarasija, S. og Norman, K. R. Måling av oksygenforbruk i intakt caenorhabditt elegansJ. Vis. Utt. (2019).

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter