Overview
I den här videon visar vi en metod för att producera en utvecklingssynkroniserad population av steril vuxen C. elegans. Exempelprotokollet synkroniserar maskar för att studera syreförbrukningshastigheter hos levande djur.
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Sarasija och Norman, Mätning av syreförbrukningshastigheter i intakt caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Tillväxt och synkronisering av nematodpopulationen
Dessa djur kommer att nå L4 larvstadiet efter ~ 42 h. Flytta vid denna tidpunkt L4 larverna med ett platinaplock till OP50 sådda NGM-plattor som innehåller 0,5 mg/ml 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUdR) för att förhindra att de producerar avkomma.
ANMÄRKNING Se till att alla stammar synkroniseras under en liknande tid i ett experiment. FUdR-behandling steriliserar djuren och förhindrar äggläggning och avkommaproduktion, vilket kan påverka OCR. Dessa steriliserade djur kommer att analyseras nästa dag (dag 1 vuxna djur på ~ 66 h) för analysen. FUdR har rapporterats påverka fysiologi och livslängd för vissa mutanta maskar. Därför bör detta beaktas när läkemedlet används för sterilisering. Maskar kan också steriliseras med hjälp av feminiserande mutationer som fem-1 (hc17) eller fem-3(e2006). Dessa mutationer kan dock påverka mitokondriell funktion.
- Överför L4 larver av önskad genetisk bakgrund (t.ex. N2 [vild typ] och sel-12 djur) till nematodtillväxtmedier (NGM) plattor (se tabell 1 för recept) nysådd med en gräsmatta av Escherichia coli (OP50). Använd minst två 100 mm eller tre 60 mm plattor för varje stam. Inkubera maskarna vid lämplig tillväxttemperatur (mellan 15–25 °C) i 3–4 dagar eller tills plattorna är koncentrerade med ett stort antal ägg och gravida maskar.
- Tvätta äggen och maskarna från plattorna med ca 6 ml M9-buffert (se tabell 1 för recept) per 100 mm tallrik nematoder och överför dem med pastörpipetter i glas till enskilda 15 ml centrifuger för varje stam. Snurra ner dessa rör i 3 min vid 6 180 x g och aspirera ut M9-bufferten och behåll bara djuren och äggpelletsen.
- Tillsätt 3–4 ml blekmedelslösning (se tabell 1 för recept) i varje rör och virvel i 6 min. Tillsätt M9-buffert för att fylla varje rör och snurra vid 6 180 x g i 1 min och aspirera övernaturligt. Upprepa denna tvätt med M9 tre gånger och flytta äggpelleten till ett färskt 15 ml-rör som innehåller cirka 9 ml M9-buffert.
- Synkronisera de nykläckta maskarna genom att muttra vid 20 °C i 16–48 timmar. Snurra ner dessa rör vid 6 180 x g i 1,5 min och lägg ner de synkroniserade L1-djuren på enskilda NGM-plattor som nyligen såts med en gräsmatta på OP50 (cirka 6 000–10 000 djur per 100 mm platta) och håll dig på 20 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1: Recept på NGM-plattor, M9-buffert och blekmedelslösning.
| M9 buffert (1 L) | |||
| dH2O (på 2000) | 1 000 ml | ||
| Nacl | 7 % | ||
| KH2PO4 (kh2PO4) | 1 % | ||
| Na2HPO4 (på Na2HPO4) | 6 g | ||
| 1 M MgSO4 | 1 ml *lägg till efter autoklavering | ||
| Dela mellan 2 flaskor: 500 ml vardera. Autoklav på vätskecykel (15 min exponering) | |||
| Blekmedelslösning (50 ml) | |||
| dH2O (på 2000) | 36 ml | ||
| Blekmedel | 14 ml | ||
| 10 N NaOH (10 N NaOH) | 800 μL | ||
| Standard Nematode Growth Media (NGM) plattor | 0 m | 0,5 L | 0,25 L |
| Nacl | 1 % | 1,5 g | 0,75 g |
| Bacto-agar (agar) | 17 g | 8,5 g | 4,25 g |
| Bacto-pepton | 2,5 g | 1,25 g | 0,625 g |
| A. Autoklav på vätskecykel (45 min exponering), låt svalna till ~60 °C och använd sedan steril teknik och tillsätt följande: |
|||
| 0 m | 0,5 L | 0,25 L | |
| 1 M CaCl2 | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| 1 M MgSO4 | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| 1 M KPO4 | 25 ml | 12,5 ml | 6,25 ml |
| 5 mg/ml kolesterol | 1 ml | 0,5 ml | 0,25 ml |
| B. Snurra för att blanda noggrant efter varje tillsats. När alla tillägg är gjorda, häll tallrikar |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm; 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900; 2901 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD; Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD; Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD; Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 |
