Dissecção da glândula linfática larval: Isolando o Órgão Produtor de Hemócitos de Drosophila

Overview

Este vídeo descreve a glândula linfática drosophila — o local principal da hematopeiese na larva da mosca — e mostra um protocolo de exemplo para dissecar e montar o órgão para imunohistoquímica e imagens fluorescentes.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Reimels e Pfleger, Métodos para Examinar a Glândula Linfática e Hemócitos em Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Imunohistoquímica larval linfática da glândula

NOTA: A glândula linfática está localizada aproximadamente um terço de comprimento da extremidade anterior de uma larva ligeiramente abaixo do cérebro no lado dorsal. (Ver seta na Figura 1B.) A glândula linfática flanqueia o vaso dorsal e é mais facilmente dissecada presa aos ganchos da boca ou ao cérebro. As glândulas linfáticas de tipo selvagem, terceira instar, são estruturas muito pequenas; os lóbulos primários têm aproximadamente 100 - 200 μm de comprimento. (Ver Figura 2A.)

1. Para obter larvas aproximadamente do mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restringir a coleta de ovos permitindo que as fêmeas coloquem ovos por um período fixo de 2 a 6 horas.
2. Dissecção da glândula linfática
   1. Para cada condição experimental, adicione 1 ml 1x PBS(Tabela 1) a um poço de uma placa de 24 poços.
   2. Adicione 1 gota de 0,1% PBST(Tabela 1) a cada poço usando uma tubulação de transferência descartável.
      NOTA: O detergente, como o Tween 20, é adicionado para diminuir a tensão superficial, permitindo que o tecido afunde até o fundo do poço.
   3. Coloque a placa plana no gelo.
   4. Coletar larvas em poços de prato dissecado cheios de 1x PBS.
   5. Coloque uma almofada de dissecação limpa em uma base estereósmica iluminada. Use uma tubulação de transferência descartável para colocar pequenas gotas de 0,01% PBST (Tabela 1) na almofada. Transfira uma larva para uma gota PBST para dissecção.
   6. Segure a larva com um par de fórceps aproximadamente um quarto de comprimento da extremidade posterior, lado dorsal para cima.
   7. Use outro par de fórceps para pegar a cutícula imediatamente anterior aos fórceps que estão segurando a larva. Puxe suavemente a cutícula em direção à extremidade anterior até que os ganchos da boca sejam expostos.
      NOTA: O objetivo é descascar a cutícula sem perturbar nenhuma estrutura interna.
   8. Solte a cutícula e use os dois fórceps para cortar a larva em dois. Remova a extremidade posterior da queda do PBST.
      NOTA: Se a cutícula não descascar todo o caminho até os ganchos da boca, corte a larva em dois e remova a extremidade posterior. Use um par de fórceps para segurar a borda da cutícula, e use o outro par de fórceps para empurrar os ganchos da boca através da abertura. Isso vai inverter a cutícula e expor os ganchos da boca. Isso também pode ser usado como um método alternativo de dissecção.
   9. Use um par de fórceps para fixar a cutícula (ou a cutícula ventral, a retalho de cutícula dorsal, ou ambos) para estabilidade.
   10. Use outro par de fórceps para pegar os ganchos de boca expostos e puxá-los suavemente para fora.
       NOTA: Isso separará a cutícula das estruturas internas. Idealmente, os discos imagináveis olho/antena, cérebro, glândula anelada e glândula linfática flanqueando o vaso dorsal permanecerão presos aos ganchos da boca.
   11. Enquanto ainda segura os ganchos da boca, remova cuidadosamente estruturas indesejadas, como as glândulas salivares, o corpo gordo e o intestino.
       NOTA: Se o cérebro se separar dos ganchos da boca, a glândula linfática ainda pode ser presa e coletada com o cérebro. Neste caso, segure o fio do nervo ventral em vez dos ganchos de boca.
   12. Usando os ganchos bucais ou o fio do nervo ventral como alça, transfira o complexo dissecado contendo a glândula linfática para o poço no gelo. Não exceda 30 minutos antes da fixação.
3. Fixação e imunohistoquímica
   1. Coloque a placa de 24 poços na base do estereoscópio.
   2. Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBST do poço.
      NOTA: Poços vazios e vizinhos são úteis para depositar temporariamente resíduos.
   3. Adicione suavemente 200 μl 3,7% de formaldeído(Tabela 1) para baixo na lateral do poço e gire a placa para garantir que os tecidos dissecados estejam completamente submersos.
   4. Devolva a placa ao gelo por 30 minutos. Se as glândulas linfáticas expressarem proteínas fluorescentes, mantenha a placa coberta para evitar fotobleaching.
   5. Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o fixador.
   6. Lave adicionando 200 μl 1x PBS ao poço e colocando a placa em um agitador orbital por 5 minutos à temperatura ambiente. Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBS.
      NOTA: Glândulas linfáticas fixas podem ser deixadas no gelo na PBS até que as glândulas linfáticas para todas as condições experimentais sejam dissecadas e fixas.
   7. Repita os passos de lavagem mais duas vezes.
   8. Adicione 200 μl de solução de permeabilização(Tabela 1) ao poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 45 minutos no RT.
      NOTA: 45 min é o "padrão-ouro" para permeabilização da glândula linfática, mas os autores têm sucesso após apenas 20 minutos.
   9. Remova a solução com uma pipeta p200.
   10. Diluir o anticorpo primário com a solução de anticorpos(Tabela 1) de acordo com as especificações do provedor. Adicione 300 μl solução de anticorpos primários ao poço e certifique-se de que os tecidos dissecados estejam completamente submersos. Incubar a 4 °C durante a noite.
   11. Use uma pipeta p200 para remover o anticorpo primário.
   12. Lave adicionando 200 μl 1x PBS ao poço e colocando a placa em um agitador orbital por 10 minutos à temperatura ambiente. Use uma pipeta p200 para remover cuidadosamente o PBS.
   13. Repita os passos de lavagem mais duas vezes.
   14. Diluir anticorpos secundários com solução de anticorpos de acordo com as especificações do provedor. Adicione 300 μl de solução de anticorpos secundários ao poço e certifique-se de que os tecidos dissecados estejam completamente submersos. Incubar em um agitador orbital por pelo menos 2 horas na RT.
   15. Use uma pipeta p200 para remover o anticorpo secundário e lave conforme descrito nas etapas 1.3.12 e 1.3.13. Não remova o PBS após a lavagem final.
4. Montagem da glândula linfática
   1. Slides de microscópio de vidro limpo usando 70% de etanol(Tabela 1) e lenços de tecido.
   2. Para cada condição experimental, coloque uma gota de tampão demontagem (Tabela 1) no slide de vidro.
      NOTA: Duas condições cabem em um slide. O volume do buffer de montagem depende do número de glândulas linfáticas a serem montadas. Use 2 μl para aproximadamente 18 - 20 glândulas linfáticas, 1 μl para 10 - 12 e 0,5 μl para 5 ou menos.
   3. Coloque o slide do microscópio em uma base estereósscope iluminada.
   4. Para até duas condições de cada vez, transfira todas as glândulas linfáticas do poço para o tampão de montagem com fórceps, usando os ganchos bucais ou o fio do nervo ventral como alça.
   5. Espaça os tecidos dissecados uniformemente em forma circular ou retangular, espalhando o tampão de montagem no processo.
   6. Para cada um dos tecidos dissecados, individualmente, deslize uma tong dos fórceps sob o vaso dorsal e puxe suavemente em direção à periferia do tampão de montagem.
      NOTA: Isso atrairá a glândula linfática do resto dos tecidos dissecados e achatará a glândula linfática no vidro.
   7. Usando uma pinça dos fórceps e um movimento de serragem, corte o vaso dorsal entre a glândula linfática e o cérebro.
   8. Mova o resto dos tecidos dissecados para o lado oposto da glândula linfática, na borda mais externa do tampão.
      NOTA: Os tecidos dissecados indesejados eventualmente formarão um perímetro ao redor das glândulas linfáticas e servirão como suporte sobre o qual a mancha de cobertura irá descansar.
   9. Repita até que todas as glândulas linfáticas sejam separadas dos tecidos dissecados, reservando um dos tecidos dissecados indesejados para colocar no centro.
   10. Tome uma mancha entre dois dedos. Verifique se o deslizamento está livre de poeira e impressões digitais. Se necessário, use uma limpeza tecidual e 70% de etanol para limpar a tampa.
   11. Garantindo que a borda da tampa seja paralela à borda do escorregador de vidro, abaixe cuidadosamente a mancha sobre o tampão de montagem.
       NOTA: Os slides do microscópio podem ser armazenados a 4 °C antes da imagem. O tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade dos anticorpos utilizados. Placas de 24 poços podem ser lavadas e reutilizadas.

2. Imagem

1. Hemócitos fixos de imagem e glândulas linfáticas montadas em uma fluorescência padrão apropriada ou microscópio confocal a 20X ou ampliação superior de acordo com o manual de operação do fabricante. Larvas inteiras de imagem em um estereótipo padrão na ampliação 2X de acordo com o manual de operação do fabricante.
2. Siga as instruções do provedor de software para desconvolução, se desejar.

Representative Results

Figura 1: Melanização de células de cristal vivo. A) As larvas foram colocadas individualmente em tubos PCR antes do aquecimento. Setas vermelhas indicam larvas que não estão na parte inferior dos tubos. B) Um padrão típico de melanização de células cristalinas após o aquecimento, que às vezes revela a glândula linfática (seta; lado dorsal mostrado, anterior é esquerda). A barra de escala representa 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imunohistoquímica larval de glândulas linfáticas. A) Uma imagem dic de uma terceira glândula linfática larval instar mostrando o vaso dorsal (dv), lóbulos primários (1°) e lóbulos secundários (2°). Barra de escala representa 100 μm. B) Uma terceira glândula linfática larval instar representativa de uma larva geneticamente expressando EBFP2 na zona medular e GFP no centro de sinalização posterior. A glândula linfática estava manchada com um anticorpo contra o domínio intracelular Notch (vermelho). Imagem sem tempo tirada com um microscópio de fluorescência (topo). A mesma imagem após a desconvolução (inferior). As barras de escala representam 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1