Larva Lenf Bezi Diseksiyonu: Drosophila Hemosit Üreten Organın İzolasyonu

Overview

Bu video, sinek larvasında hematopoezisin birincil yeri olan Drosophila lenf bezini açıklar ve immünofizokimya ve floresan görüntüleme için organı parçalamak ve monte etmek için örnek bir protokol göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Reimels ve Pfleger'den bir alıntıdır, Drosophila Larvalarında Lenf Bezi ve Hemositleri İnceleme Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2016).

1. Larva Lenf Bezi İmmünohistok entrika

NOT: Lenf bezi, sırt tarafındaki beynin biraz altında bir larvanın ön ucundan yaklaşık üçte bir uzunluğunda bulunur. (Şekil 1B'dekioka bakın.) Lenf bezi sırt damarını kuşatır ve en kolay ağız kancalarına veya beyne bağlı olarak parçalara bağlanır. Vahşi tip, üçüncü başlangıçlı lenf bezleri çok küçük yapılardır; birincil loblar yaklaşık 100 - 200 μm uzunluğundadır. (Bkz. Şekil 2A.)

1. Bu test için kabaca aynı gelişim aşamasında larva elde etmek için, dişilerin 2 - 6 saatlik sabit bir süre boyunca yumurta bırakmasına izin vererek yumurta toplamayı kısıtlayın.
2. Lenf bezi diseksiyonu
   1. Her deneysel durum için, 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna 1 ml1xPBS ( Tablo 1 ) ekleyin.
   2. Tek kullanımlık transfer pipeti kullanarak her kuyuya %0,1 PBST(Tablo 1) 1damla ekleyin.
      NOT: Tween 20 gibi deterjan, yüzey gerilimini azaltmak için eklenir ve dokunun kuyunun dibine batmasını sağlar.
   3. Tabağı düz bir şekilde buza yerleştirin.
   4. Larvaları 1x PBS ile dolu diseksiyon kabı kuyularında toplayın.
   5. Işıklı stereomikroskop tabanına temiz bir diseksiyon pedi yerleştirin. Ped üzerine % 0,01 PBST(Tablo 1)küçük damlalar yerleştirmek için tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın. Bir larvayı diseksiyon için PBST damlasına aktarın.
   6. Larvaları arka uçtan yaklaşık dörtte bir uzunlukta bir çift yabanayı ile tutun, sırt tarafı yukarı.
   7. Kütikülün larvayı tutan tokmakların hemen önünden kapmak için başka bir çift tokmak kullanın. Ağız kancaları açığa çıkana kadar kütikülleri ön uca doğru hafifçe çekin.
      NOT: Amaç, herhangi bir iç yapıyı bozmadan tiksini soymaktır.
   8. Kütikül serbest bırakın ve larvayı ikiye kesmek için her iki asayı da kullanın. Arka ucu PBST damlasından çıkarın.
      NOT: Manikür ağız kancalarına kadar soyulmazsa, larvaları ikiye bölün ve arka ucini çıkarın. Manikürün kenarını tutmak için bir çift önsezi kullanın ve ağız kancalarını açıklıktan itmek için diğer çift asaları kullanın. Bu, manikleyi ters çevirecek ve ağız kancalarını açığa çıkaracaktır. Bu, alternatif bir diseksiyon yöntemi olarak da kullanılabilir.
   9. Stabilite için kütikül (ventral kütikül, sırt kütikül kapağı veya her ikisi) sabitlemek için bir çift forseps kullanın.
   10. Açıkta kalan ağız kancalarını kapmak ve yavaşça çıkarmak için başka bir çift toparlama kullanın.
       NOT: Bu, manikleyi iç yapılardan ayıracaktır. İdeal olarak, sırt damarını kuşayan göz/antenli imaginal diskler, beyin, halka bezi ve lenf bezi ağız kancalarına bağlı kalacaktır.
   11. Hala ağız kancalarını tutarken, tükürük bezleri, yağ gövdesi ve bağırsak gibi istenmeyen yapıları dikkatlice çıkarın.
       NOT: Beyin ağız kancalarından ayrılırsa, lenf bezi hala beyne bağlı ve beyinle toplanabilir. Bu durumda ağız kancaları yerine ventral sinir kordonu tutun.
   12. Ağız kancalarını veya ventral sinir kordonu bir tutamak olarak kullanarak, lenf bezini içeren parçalanmış kompleksi buz üzerindeki kuyuya aktarın. Sabitlemeden önce 30 dakikayı aşmayın.
3. Fiksasyon ve immünhistokimya
   1. 24 kuyu plakasını stereomikroskop tabanına yerleştirin.
   2. PBST'yi kuyudan dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipet kullanın.
      NOT: Boş, komşu kuyular geçici olarak atık biriktirmek için yararlıdır.
   3. Kuyunun kenarına 200 μl% 3.7 formaldehit (Tablo 1) ekleyin ve parçalanmış dokuların tamamen su altında kalmasını sağlamak için plakayı döndürün.
   4. Tabağı 30 dakika boyunca buza geri verin. Lenf bezleri floresan proteinleri ifade ediyorsa, fotobleachingi önlemek için plakayı kapalı tutun.
   5. Fiksatifi dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipet kullanın.
   6. Kuyuya 200 μl 1x PBS ekleyerek ve plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirerek yıkayın. PBS'yi dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipet kullanın.
      NOT: Sabit lenf bezleri, tüm deneysel durumlar için lenf bezleri parçalanıp sabitlenene kadar PBS'de buz üzerinde bırakılabilir.
   7. Yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   8. Kuyuya 200 μl permeabilizasyon çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Plakayı RT'de 45 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya ayarlayın.
      NOT: 45 dk lenf bezi permeabilizasyonu için "altın standarttır", ancak yazarlar sadece 20 dakika sonra başarıya sahiptir.
   9. Çözeltiyi bir p200 pipetle çıkarın.
   10. Birincil antikoru sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi (Tablo 1) ile seyreltin. Kuyuya 300 μl primer antikor çözeltisi ekleyin ve parçalanmış dokuların tamamen su altında kalmasını sağlayın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yaslanın.
   11. Birincil antikoru çıkarmak için bir p200 pipet kullanın.
   12. Kuyuya 200 μl 1x PBS ekleyerek ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirerek yıkayın. PBS'yi dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipet kullanın.
   13. Yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   14. İkincil antikorları sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi ile seyreltin. Kuyuya 300 μl ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve parçalanmış dokuların tamamen su altında kalmasını sağlayın. RT'de en az 2 saat yörüngesel çalkalayıcıda kuluçkaya yatır.
   15. İkincil antikorun çıkarılması ve Adım 1.3.12 ve 1.3.13'te açıklandığı gibi yıkanması için bir p200 pipet kullanın. Son yıkamadan sonra PBS'yi çıkarmayın.
4. Lenf bezi montajı
   1. Cam mikroskop slaytlarını % 70 etanol (Tablo 1) ve doku mendilleri kullanarak temizleyin.
   2. Her deneysel durum için, cam kaydırağın üzerine bir damla montaj tamponu (Tablo 1) yerleştirin.
      NOT: Bir slayta iki koşul sığar. Montaj tampon hacmi monte edilecek lenf bezlerinin sayısına bağlıdır. Yaklaşık 18 - 20 lenf bezi için 2 μl, 10 - 12 için 1 μl ve 5 veya daha az için 0,5 μl kullanın.
   3. Mikroskop kaydırağı ışıklı bir stereomikroskop tabanına yerleştirin.
   4. Aynı anda iki adede kadar koşul için, ağız kancalarını veya ventral sinir kordonu bir tutamak olarak kullanarak, tüm lenf bezlerini kuyudan forseps ile montaj tamponuna aktarın.
   5. Parçalanmış dokuları dairesel veya dikdörtgen bir şekilde eşit olarak boşluk bırakarak montaj tamponu işlemde yayılır.
   6. Parçalanmış dokuların her biri için, ayrı ayrı, forsepslerin bir maşasını sırt kabının altına kaydırın ve montaj tamponunun çevresine doğru hafifçe çekin.
      NOT: Bu, lenf bezini parçalanmış dokuların geri kalanından çekecek ve lenf bezini camda düzleştirecektir.
   7. Bir çatal maşası ve bir testere hareketi kullanarak, lenf bezi ile beyin arasındaki sırt damarını kesin.
   8. Parçalanmış dokuların geri kalanını tamponun en dış kenarında lenf bezinin karşı tarafına hareket ettirin.
      NOT: İstenmeyen parçalanmış dokular sonunda lenf bezlerinin etrafında bir çevre oluşturacak ve kapak kapağının dinlenecekleri bir destek görevi görecektir.
   9. Tüm lenf bezleri parçalanmış dokulardan ayrılana kadar tekrarlayın, istenmeyen parçalanmış dokulardan birini merkeze yerleştirmek için ayırın.
   10. İki parmağın arasına bir kapak kılıfı al. Kapak kapağının toz ve parmak izi içermediğini kontrol edin. Gerekirse, kapakları temizlemek için bir doku mendili ve% 70 etanol kullanın.
   11. Kapak kapağının kenarının cam kaydırağın kenarına paralel olduğundan emin olun, kapak kapağını montaj tamponunun üzerine dikkatlice küt.
       NOT: Mikroskop slaytları görüntülemeden önce 4 °C'de saklanabilir. Maksimum depolama süresi, kullanılan antikorların stabiliteye bağlıdır. 24 kuyu plakaları durulanabilir ve tekrar kullanılabilir.

2. Görüntüleme

1. Üreticinin kullanım kılavuzuna göre 20X veya daha yüksek büyütmede uygun bir standart floresan veya konfokal mikroskop üzerinde görüntü sabit hemositler ve monte lenf bezleri. Üreticinin kullanım kılavuzuna göre 2X büyütmede standart bir stereomikroskopta tüm larvaları görüntüleyin.
2. İsterseniz yazılım sağlayıcısının dekonvolüzyon talimatlarını izleyin.

Representative Results

Şekil 1: In Vivo Kristal Hücre Melanizasyonu. A) Larvalar ısınmadan önce PCR tüplerine ayrı ayrı yerleştirildi. Kırmızı oklar, tüplerin dibinde olmayan larvaları gösterir. B) Isıtma sonrası tipik bir kristal hücre melanizasyon deseni, bazen lenf bezini ortaya çıkaran (ok; sırt tarafı gösterilmiştir, ön taraf bırakılır). Ölçek çubuğu 1 mm'yi temsil eder.

Şekil 2: Larva Lenf Bezi İmmünhistokmi. A) Dorsal damarı (dv), primer lobları (1°) ve ikincil lobları (2°) gösteren üçüncü bir instar larva lenf bezinin DIC görüntüsü. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. B) Medüller bölgede EBFP2'yi ve arka sinyal merkezinde GFP'yi genetik olarak ifade eden bir larvadan temsil eden üçüncü bir başlangıç larva lenf bezi. Lenf bezi Çentik hücre içi etki alanına (kırmızı) karşı bir antikor ile lekelendi. Floresan mikroskopla (üstte) çekilen değiştirilmemiş görüntü. Dekonvolution sonra aynı görüntü (altta). Ölçek çubukları 20 μm'yi temsil eder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1