Larval Lymph Drüsensektion: Isolierung des Drosophila Hämose-produzierenden Organs

Overview

Dieses Video beschreibt die Drosophila-Lymphdrüse – die primäre Stelle der Hämatopoese in der Fliegenlarve – und zeigt ein Beispielprotokoll zur Sezieren und Montage des Organs für Immunhistochemie und fluoreszierende Bildgebung.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Reimels und Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).

1. Larval Lymph Drüsen-Immunhistochemie

HINWEIS: Die Lymphdrüse befindet sich etwa ein Drittel Länge vom vorderen Ende einer Larve etwas unterhalb des Gehirns auf der Rückenseite. (Siehe Pfeil in Abbildung 1B.) Die Lymphdrüse flankiert das Rückengefäß und lässt sich am einfachsten an den Mundhaken oder am Gehirn sezieren. Wildtyp, dritte inStar-Lymphdrüsen sind sehr kleine Strukturen; die Primärlappen sind ca. 100 - 200 m lang. (Siehe Abbildung 2A.)

1. Um Larven von ungefähr der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Sie die Eiersammlung, indem sie Den Weibchen erlauben, Eier für einen bestimmten Zeitraum von 2 - 6 Stunden zu legen.
2. Lymphdrüsensektion
   1. Für jede experimentelle Erkrankung 1 ml 1x PBS (Tabelle 1) zu einem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen.
   2. Fügen Sie mit einer Einweg-Transferpipette jeweils einen Tropfen 0,1% PBST (Tabelle 1) zu jedem Brunnen hinzu.
      HINWEIS: Reinigungsmittel, wie Tween 20, wird hinzugefügt, um die Oberflächenspannung zu senken, so dass das Gewebe auf den Boden des Brunnens sinken kann.
   3. Legen Sie die Platte flach auf Eis.
   4. Sammeln Sie Larven in Sezieren Vonsetenbrunnen gefüllt mit 1x PBS.
   5. Legen Sie ein sauberes Sezieren auf eine beleuchtete Stereomikroskopbasis. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette, um kleine Tropfen von 0,01% PBST (Tabelle 1) auf das Pad zu legen. Übertragen Sie eine Larve auf einen PBST-Tropfen zur Zerlegung.
   6. Halten Sie die Larve mit einem Paar Zangen etwa ein Viertel Länge vom hinteren Ende, dorsale Seite nach oben.
   7. Verwenden Sie ein anderes Zangenpaar, um die Nagelhaut sofort vor der Zange zu greifen, die die Larve hält. Ziehen Sie die Nagelhaut vorsichtig in Richtung des vorderen Endes, bis die Mundhaken freigelegt sind.
      HINWEIS: Ziel ist es, die Nagelhaut zu schälen, ohne die inneren Strukturen zu stören.
   8. Lassen Sie die Nagelhaut los und verwenden Sie beide Zangen, um die Larve in zwei zu schneiden. Entfernen Sie das hintere Ende aus dem PBST-Drop.
      HINWEIS: Wenn die Nagelhaut nicht den ganzen Weg zu den Mundhaken schälen, schneiden Sie die Larve in zwei und entfernen Sie das hintere Ende. Verwenden Sie ein Zangenpaar, um die Kante der Nagelhaut zu halten, und verwenden Sie das andere Zangenpaar, um die Mundhaken durch die Öffnung zu drücken. Dadurch wird die Nagelhaut umgedreht und die Mundhaken freisetzen. Dies kann auch als alternative Seziermethode verwendet werden.
   9. Verwenden Sie ein Paar Zangen, um die Nagelhaut (entweder die ventrale Nagelhaut, die dorsale Nagelklappe oder beides) für Stabilität festzunageln.
   10. Verwenden Sie ein weiteres Zangenpaar, um die freiliegenden Mundhaken zu greifen und sie vorsichtig herauszuziehen.
       HINWEIS: Dadurch wird die Nagelhaut von den inneren Strukturen getrennt. Idealerweise bleiben die Augen-/Antennen-Aginalscheiben, Gehirn-, Ringdrüse und Lymphdrüse, die das Rückengefäß flankieren, an den Mundhaken befestigt.
   11. Während Sie noch die Mundhaken halten, entfernen Sie sorgfältig unerwünschte Strukturen wie die Speicheldrüsen, Fettkörper, und Darm.
       HINWEIS: Wenn sich das Gehirn von den Mundhaken trennt, kann die Lymphdrüse immer noch an das Gehirn gebunden und mit ihm gesammelt werden. Halten Sie in diesem Fall die ventrale Nervenschnur anstelle der Mundhaken.
   12. Übertragen Sie den sezierten Komplex mit der Lymphdrüse mit den Mundhaken oder der ventralen Nervenschnur als Griff auf den Brunnen auf Eis. Nicht mehr als 30 min vor der Fixierung.
3. Fixierung und Immunhistochemie
   1. Legen Sie die 24-Well-Platte auf die Stereomikroskopbasis.
   2. Verwenden Sie eine p200 Pipette, um den PBST vorsichtig aus dem Brunnen zu entfernen.
      HINWEIS: Leere, benachbarte Brunnen sind nützlich, um vorübergehend Abfall zu deponieren.
   3. Fügen Sie vorsichtig 200 l 3,7% Formaldehyd (Tabelle 1) an der Seite des Brunnens hinzu und wirbeln Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind.
   4. Bringen Sie die Platte für 30 min auf Eis zurück. Wenn die Lymphdrüsen fluoreszierendes Protein(en) ausdrücken, halten Sie die Platte bedeckt, um Photobleichungen zu verhindern.
   5. Verwenden Sie eine p200 Pipette, um das Fixativ sorgfältig zu entfernen.
   6. Waschen Sie, indem Sie dem Brunnen 200 l 1x PBS hinzufügen und die Platte 5 min bei Raumtemperatur auf einen Orbital-Shaker legen. Verwenden Sie eine p200 Pipette, um die PBS sorgfältig zu entfernen.
      HINWEIS: Feste Lymphdrüsen können in PBS auf Eis gelassen werden, bis Lymphdrüsen für alle experimentellen Bedingungen seziert und fixiert werden.
   7. Wiederholen Sie die Waschschritte zwei weitere Male.
   8. Fügen Sie dem Brunnen eine Permeabilisationslösung von 200 l (Tabelle 1) hinzu. Stellen Sie die Platte auf einen Orbital-Shaker für 45 min bei RT.
      HINWEIS: 45 min ist der "Goldstandard" für Lymphdrüsenpermebilisation, aber die Autoren haben Erfolg nach nur 20 min.
   9. Entfernen Sie die Lösung mit einer p200 Pipette.
   10. Primärantikörper mit Antikörperlösung verdünnen (Tabelle 1) nach den Spezifikationen des Anbieters. Fügen Sie dem Brunnen eine primäre Antikörperlösung von 300 l hinzu und stellen Sie sicher, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
   11. Verwenden Sie eine p200 Pipette, um den primären Antikörper zu entfernen.
   12. Waschen Sie, indem Sie dem Brunnen 200 l 1x PBS hinzufügen und die Platte 10 min bei Raumtemperatur auf einen Orbital-Shaker legen. Verwenden Sie eine p200 Pipette, um die PBS sorgfältig zu entfernen.
   13. Wiederholen Sie die Waschschritte zwei weitere Male.
   14. Sekundärantikörper mit Antikörperlösung nach Denedaten des Anbieters verdünnen. Fügen Sie dem Brunnen eine sekundäre Antikörperlösung von 300 l hinzu und stellen Sie sicher, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind. Inkubieren Sie auf einem Orbital-Shaker für mindestens 2 Stunden bei RT.
   15. Verwenden Sie eine p200 Pipette, um den sekundären Antikörper zu entfernen und zu waschen, wie in den Schritten 1.3.12 & 1.3.13 beschrieben. Entfernen Sie das PBS nach der letzten Wäsche nicht.
4. Lymphdrüsenbefestigung
   1. Saubere Glasmikroskop-Dias mit 70% Ethanol (Tabelle 1) und Gewebetüchern.
   2. Legen Sie für jede versuchsweise Bedingung einen Tropfen Montagepuffer (Tabelle 1) auf die Glasrutsche.
      HINWEIS: Zwei Bedingungen passen auf eine Rutsche. Das Montagepuffervolumen hängt von der Anzahl der zu montierenden Lymphdrüsen ab. Verwenden Sie 2 l für ca. 18 - 20 Lymphdrüsen, 1 l für 10 - 12 und 0,5 l für 5 oder weniger.
   3. Platzieren Sie das Mikroskopschlitten auf einer beleuchteten Stereomikroskopbasis.
   4. Für bis zu zwei Bedingungen gleichzeitig, übertragen Sie alle Lymphdrüsen aus dem Brunnen auf den Montagepuffer mit Zange, mit den Mundhaken oder ventralen Nervenschnur als Griff.
   5. Räumen Sie die sezierten Gewebe gleichmäßig in einer kreisförmigen oder rechteckigen Form, wodurch der Montagepuffer verteilt wird.
   6. Für jedes der sezierten Gewebe, einzeln, schieben Sie eine Zange der Zange unter das Rückengefäß und ziehen Sie sanft in Richtung der Peripherie des Montagepuffers.
      HINWEIS: Dadurch wird die Lymphdrüse aus dem Rest des sezierten Gewebes gezogen und die Lymphdrüse auf dem Glas abgeflacht.
   7. Schneiden Sie mit einer Zange und einer Sägebewegung das Rückengefäß zwischen lymphanieoder Lymphdrüse und Gehirn.
   8. Bewegen Sie den Rest des sezierten Gewebes auf die gegenüberliegende Seite der Lymphdrüse, am äußersten Rand des Puffers.
      HINWEIS: Die unerwünschten sezierten Gewebe bilden schließlich einen Umfang um die Lymphdrüsen und dienen als Stütze, auf der der Deckelrutsch ruhen wird.
   9. Wiederholen Sie dies, bis alle Lymphdrüsen von den sezierten Geweben getrennt sind, und eines der unerwünschten sezierten Gewebe in der Mitte zu platzieren.
   10. Nehmen Sie einen Coverslip zwischen zwei Fingern. Prüfen Sie, ob der Deckelrutsch frei von Staub und Fingerabdrücken ist. Verwenden Sie bei Bedarf ein Gewebetuch und 70 % Ethanol, um den Deckelzuschlag zu reinigen.
   11. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Deckels parallel zur Kante des Glasschlittens verläuft, und senken Sie den Abdeckungsschlupf vorsichtig über dem Montagepuffer.
       HINWEIS: Mikroskopschlitten können vor der Bildgebung bei 4 °C gelagert werden. Die maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der eingesetzten Antikörper ab. 24-Well-Platten können gespült und wiederverwendet werden.

2. Imaging

1. Bild fixierte Hämozyten und montierte Lymphdrüsen auf einem geeigneten Standardfluoreszenz- oder Konfokalmikroskop bei 20-facher oder höherer Vergrößerung gemäß DerBetriebsanleitung des Herstellers. Bild ganze Larven auf einem Standard-Stereomikroskop bei 2-facher Vergrößerung nach Herstelleranleitung.
2. Folgen Sie den Anweisungen des Softwareanbieters zur Dekonvolution, falls gewünscht.

Representative Results

Abbildung 1: In Vivo Kristallzellmelanisierung. A) Larven wurden vor dem Erhitzen einzeln in PCR-Röhren platziert. Rote Pfeile zeigen Larven an, die sich nicht am unteren Rand der Rohre befinden. B) Ein typisches Kristallzell-Melanisationsmuster nach dem Erhitzen, das manchmal die Lymphdrüse offenbart (Pfeil; dorsale Seite gezeigt, vorderes ist links). Maßstabsleiste steht für 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Larval Lymph Drüsen-Immunhistochemie. A) Ein DIC-Bild einer dritten Insternlarvenlymphdrüse, das das Rückengefäß (dv), Primärlappen (1°) und Sekundärlappen (2°) zeigt. Scale bar steht für 100 m. B) Eine repräsentative dritte instarlarven Lymphdrüse aus einer Larve, die EBFP2 in der medullären Zone genetisch ausdrückt, und GFP im hinteren Signalzentrum. Die Lymphdrüse wurde mit einem Antikörper gegen die kerb intrazelluläre Domäne (rot) gefärbt. Unverändertes Bild, aufgenommen mit einem Fluoreszenzmikroskop (oben). Das gleiche Bild nach der Dekonvolution (unten). Maßstabsbalken stellen 20 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1