إعداد الخلايا النزفية الثابتة لاحتواء المناعة: طريقة عالية الإنتاجية لإصلاح وإزالة الغشاء الخارجي

Overview

يمكن أن يكون التأني المناعي للبويضات في مرحلة متأخرة من دروسوفيلا تحديا بسبب الأغشية المحيطة بالبويضات. يصف هذا الفيديو طريقة عالية الإنتاجية للحصول على البويضات ، تثبيتها ، وإزالة الأغشية لاحتواء المناعة. يوضح البروتوكول المميز هذه التقنيات باستخدام البويضات في المراحل المتأخرة المستخدمة لتصور مراحل مختلفة من الإصابة بالخلايا النيوزية.

Protocol

هذا البروتوكول مقتطف من رادفورد ومكيم، وتقنيات التصوير بروميتافاس وميتافيزي من Meiosis الأول في الخلايا النزفية الثابتة، J. Vis. Exp. (2016).

ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. وتستخدم الحاضنات التي تسيطر عليها درجة الحرارة للحفاظ على درجات الحرارة لتربية الذباب والصلبان ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. الاستعدادات

1. إعداد الذباب.
   1. مجموعات البويضات المخصبة بروميتافاس.
      1. يطير الكبار واضحة من الأسهم صحية، والشباب أو عبر الثقافات. زجاجات العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
         ملاحظة: عموما، زجاجتين صحية تكفي، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى المزيد لبعض الثقافات المتقاطعة.
      2. بعد يومين، وجمع ~ 100 إلى 300 الإناث (الذين هم 0-2 أيام من العمر في هذه المرحلة) من الزجاجات. الإناث لا تحتاج إلى أن تكون العذارى. إضافة داب من عجينة الخميرة إلى جانب قارورة ووضع 30 الإناث و 10 إلى 15 الذكور كل في قارورة الخميرة. قارورة العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
   2. مجموعات البويضات المخصبة ميتافايز.
      1. جمع ~ 100 إلى 300 الإناث من المخزون أو عبر الثقافات. إضافة داب من عجينة الخميرة إلى جانب قارورة ووضع 30 الإناث لكل منهما (مع عدم إضافة الذكور) في قوارير الخميرة. قنينات العمر لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام عند 25 درجة مئوية.
2. إعداد الحلول.
   ملاحظة: يمكن تخزين الحلول إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة، ما لم يذكر خلاف ذلك.
   1. إعداد تعديل روب العازلة (5x): 500 MM HEPES, 500 mM السكروز, 275 mM خلات الصوديوم, 200 mM خلات البوتاسيوم, 50 mM الجلوكوز, 6 mM كلوريد المغنيسيوم, و 5 MM كلوريد الكالسيوم. استخدام 10 N 11:8 هيدروكسيد الصوديوم: هيدروكسيد البوتاسيوم لجلب pH إلى 7.4. تعقيم عن طريق الترشيح. لا الأوتوكلاف. يخزن عند -20 درجة مئوية. ذوبان حسب الحاجة لإعداد ~ 200 مل من 1x روب في الإعدادية البويضات.
   2. حلول التثبيت.
      1. الخيار #1: إعداد تثبيت الفورمالديهايد/الهيبتان. إعداد التثبيت العازلة: 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) بالإضافة إلى 150 mM السكروز. للاستخدام، وجعل جديدة مع 687.5 ميكرولتر تثبيت العازلة و 312.5 ميكرولتر 16٪ الفورمالديهايد لكل الإعدادية البويضات.
         تحذير: ارتداء قفازات أثناء استخدام حلول الفورمالديهايد في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
      2. الخيار #2: إعداد تثبيت الفورمالديهايد/كاكوديلات. إعداد مزيج الإصلاح: 250 mM السكروز, 100 mM خلات البوتاسيوم (pH 7.5), 25 mM خلات الصوديوم (pH 7.0), و 25 mM EGTA (pH 8.0). للاستخدام، وجعل الطازجة مع 400 ميكرولتر فيس ميكس، 100 ميكرولتر البوتاسيوم cacodylate (1 M، درجة الحموضة 7.2)، و 500 ميكرولتر 16٪ الفورمالديهايد لكل الإعدادية oocyte.
         تحذير: يحتوي صبار البوتاسيوم على الزرنيخ.
   3. إعداد برنامج تلفزيوني / تريتون X - 100 : 1x برنامج تلفزيوني زائد 1 ٪ أو 0.05 ٪ تريتون العاشر - 100. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   4. إعداد PBS-توين 20-الأبقار مصل الألبومين (BSA) (PTB): 1x PBS, 0.5٪ BSA (ث / v), و 0.1٪ توين-20. قد يتم تخزينها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.

2. مجموعة من الخلايا الدروسوفيليا في مرحلة متأخرة

1. كما البويضات Drosophila مع الأغشية سليمة سوف التمسك البلاستيك والزجاج، قبل معطف داخل أنبوب واحد 5 مل وماصة باستور واحد لكل الإعدادية البويضات مع PTB.
2. تخدير جميع ~ 100 إلى 300 الذباب الخميرة مع ثاني أكسيد الكربون وإضافة إلى خلاط يحتوي على ~ 100 مل 1x روب العازلة. نبض ثلاث مرات (~ 1 ثانية لكل منهما). الحفاظ على البويضات في روب ل < 20 دقيقة لتجنب التنشيط.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، قد يتم تشريح البويضات يدويا من الإناث. وميزة هذه الطريقة هو أنه يتطلب أقل الإناث. ومع ذلك، يجب توخي الحذر للحد من التعرض لثاني أكسيد الكربون لبضع دقائق فقط لتجنب القطع الأثرية المرتبطة بنقص الأكسيجة.
3. تصفية من خلال شبكة كبيرة (~ 1500 ميكرومتر) في كوب 250 مل لإزالة أجزاء الجسم الكبيرة. إذا ظلت العديد من البطن سليمة على شبكة، وإعادة طحن المواد باستخدام العازلة روب إضافية، وتصفية مرة أخرى. اسمحوا تسوية ~ 2 دقيقة، ثم يستنشق قبالة الطبقة العليا، وإزالة أكبر عدد ممكن من أجزاء الجسم الكبيرة.
4. تصفية من خلال شبكة صغيرة (~ 300 ميكرومتر) في كوب 250 مل. شطف البويضات المتبقية من الكأس الأولى باستخدام روب إضافية والمغلفة باستور pipet. اسمحوا تسوية ~ 3 دقيقة. سوف تستقر البويضات. أسبيرات قبالة جميع ما عدا ~ 10 مل.
5. صب أكبر قدر من 10 مل كما سوف يصلح في أنبوب 5 مل المغلفة. السماح لتسوية، وإزالة السائل، وكرر مع ما تبقى. شطف البويضات المتبقية من الكأس باستخدام روب إضافية والمغلفة باستور ماصة. اسمحوا تسوية في أنبوب 5 مل ل ~ 3-5 دقيقة.

3. العلاجات الدوائية (اختياري)

1. معطف أنبوب 5 مل الثانية مع PTB لكل الإعدادية البويضات. إضافة المذيبات المناسبة (السيطرة) أو المخدرات إلى 1 مل روب لكل الإعدادية البويضات (الجدول 1).
2. تقسيم البويضات إلى أنبوب 5 مل المغلفة الثانية. اسمحوا تسوية, إزالة السائل, وإضافة 1 مل روب زائد المذيبات في أنبوب واحد و 1 مل روب بالإضافة إلى المخدرات في أنبوب الثاني. Nutate لفترة مناسبة من الوقت لعلاج المخدرات (الجدول 1). دع التسوية.

4. التثبيت

1. أسبيرات قبالة جميع السائل وإضافة فورا 1 مل الإصلاح.
2. الخيار #1: تثبيت الفورمالديهايد/الهبتان (التثبيت المخزن المؤقت بالإضافة إلى 5٪ الفورمالديهايد).
   1. إصلاح لمدة 2.5 دقيقة على نوتاتور. إضافة 1 مل هيبتان ودوامة 1 دقيقة. اسمحوا تسوية ~ 1 دقيقة.
   2. إزالة جميع السائل، ومن ثم إضافة 1 مل 1x PBS. دوامة 30 ثانية. اسمحوا تسوية ~ 1 دقيقة.
   3. إزالة جميع السائل، ومن ثم ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني 1x.
      ملاحظة: يمكن استخدام البويضات على الفور أو الاحتفاظ بها على جهاز nutator لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة.
3. الخيار #2: تثبيت الفورمالديهايد/كاكوديلات (إصلاح ميكس بالإضافة إلى 8٪ الفورمالديهايد و100 مليون كاكوديلات).
   1. إصلاح لمدة 6 دقائق على نوتاتور. اسمحوا تسوية 2 دقيقة. إزالة السائل، ومن ثم ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني 1x.
      ملاحظة: يمكن استخدام البويضات على الفور أو الاحتفاظ بها على جهاز nutator لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة.

5. إزالة الأغشية ("المتداول")

1. باستخدام ماصة باستور المغلفة، إضافة ~ 500 إلى 1000 البويضات إلى الجزء المتجمد (الرمل انتقد) من شريحة زجاجية. إزالة جميع أجزاء الجسم والمواد الدخيلة باستخدام ملقط. لا تدع البويضات تجف. إضافة 1x برنامج تلفزيوني حسب الضرورة.
2. وضع غطاء على رأس البويضات وبلطف "لفة" البويضات حتى تتم إزالة جميع الأغشية (سحب حافة الغطاء عبر البويضات يعمل بشكل أفضل). تحقق دوريا التقدم تحت المجهر، مضيفا المزيد من برنامج تلفزيوني 1x حسب الضرورة. العناية كما الكثير من الضغط سوف تدمر البويضات.

Representative Results

دواء	المذيبات	تركيز المخزون	التركيز النهائي	وقت العلاج	أثر
كولشيسين	ايثانول	125 مليون متر	150 ميكرومتر	10 دقائق أو 30 دقيقة	زعزعة استقرار غير kinetochore (10 دقيقة) أو كل (30 دقيقة) microtubules
باكليتاكسيل	DMSO	10 mM	10 ميكرومتر	10 دقائق	استقرار المصابيح الدقيقة
بينوكلين 2	DMSO	25 مليون متر	25 ميكرومتر	20 دقيقة	تمنع أورورا B كيناز

الجدول 1: العلاج من المخدرات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various