Preparação de Oócitos de Drosophila Fixo para Imunostaining: Um Método de Alto Rendimento para Fixar e Remover a Membrana Externa
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (2016).
A imunossuagem de oócitos de Drosophila em estágio final pode ser desafiadora devido às membranas circundantes dos oócitos. Este vídeo descreve um método de alta produtividade para a obtenção de oócitos, sua fixação e remoção de membranas para imunossagens. O protocolo em destaque demonstra essas técnicas com oócitos em estágio final utilizados para visualizar diferentes estágios da meiose.
Protocol
Este protocolo é extraído de Radford e McKim, Techniques for Imaging Prometaphase e Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). NOTA: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, a menos que seja observado em contrário. Incubadoras controladas pela temperatura são usadas para manter temperaturas para criação de moscas e cruzes, a menos que seja observado de outra forma. 1….
Representative Results
medicamento solvente Concentração de estoque Concentração final Tempo de tratamento efeito colquicina etanol 125 mM 150 μM 10 min ou 30 min desestabilizar não-kinetochore (10 min)ou todos (…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).