Preparação de Oócitos de Drosophila Fixo para Imunostaining: Um Método de Alto Rendimento para Fixar e Remover a Membrana Externa

Overview

A imunossuagem de oócitos de Drosophila em estágio final pode ser desafiadora devido às membranas circundantes dos oócitos. Este vídeo descreve um método de alta produtividade para a obtenção de oócitos, sua fixação e remoção de membranas para imunossagens. O protocolo em destaque demonstra essas técnicas com oócitos em estágio final utilizados para visualizar diferentes estágios da meiose.

Protocol

Este protocolo é extraído de Radford e McKim, Techniques for Imaging Prometaphase e Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

NOTA: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, a menos que seja observado em contrário. Incubadoras controladas pela temperatura são usadas para manter temperaturas para criação de moscas e cruzes, a menos que seja observado de outra forma.

1. Preparativos

1. Prepare moscas.
   1. Coleções de oócito enriquecidas com prometafase.
      1. Claro adulto voa de animais saudáveis, jovens ou culturas cruzadas. Garrafas etárias por dois dias a 25 °C.
         NOTA: Geralmente, duas garrafas saudáveis serão suficientes, embora mais possam ser necessárias para algumas culturas cruzadas.
      2. Após dois dias, recolham ~100 a 300 fêmeas (que têm de 0 a 2 dias neste momento) das garrafas. As fêmeas não precisam ser virgens. Adicione um pouco de pasta de levedura ao lado de um frasco e coloque 30 fêmeas e 10 a 15 machos cada um nos frascos de leveduras. Frascos de idade por dois dias a 25 °C.
   2. Coleções de Oócito enriquecidas com metafase.
      1. Colete ~100 a 300 fêmeas de estoque ou culturas cruzadas. Adicione um pouco de pasta de levedura ao lado de um frasco e coloque 30 fêmeas cada uma (sem machos adicionados) nos frascos de leveduras. Frascos de idade por três a cinco dias a 25 °C.
2. Prepare soluções.
   NOTA: As soluções podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, a menos que seja observada em contrário.
   1. Prepare o tampão de robb modificado (5x): 500 mM HEPES, 500 mM de sacarose, acetato de sódio de 275 mM, acetato de potássio de 200 mM, glicose de 50 mM, cloreto de magnésio de 6 mM e cloreto de cálcio de 5 mM. Use 10 N 11:8 hidróxido de sódio:hidróxido de potássio para levar pH a 7,4. Esterilizar por filtragem; não autoclave. Armazenar a -20 °C. Descongele conforme necessário para preparar ~200 ml de 1x Robb's por prep oócito.
   2. Soluções de fixação.
      1. Opção #1: Prepare a fixação formaldeído/heptano. Prepare o tampão de fixação: 1x salina tamponada com fosfato (PBS) mais 150 mM de sacarose. Para usar, faça fresco com 687,5 μl tampão de fixação e 312,5 μl 16% formaldeído por prep oócito.
         ATENÇÃO: Use luvas enquanto usa soluções de formaldeído em um capô de fumaça. Descarte resíduos de acordo com as diretrizes institucionais.
      2. Opção #2: Prepare a fixação formaldeído/cacodilato. Prepare a mistura de correção: 250 mM de sacarose, acetato de potássio de 100 mM (pH 7,5), acetato de sódio de 25 mM (pH 7.0) e 25 mM EGTA (pH 8.0). Para usar, faça fresco com 400 μl Fix Mix, 100 μl de cacodilato de potássio (1 M, pH 7.2) e 500 μl 16% de formaldeído por prep oócito.
         ATENÇÃO: Cacodilato de potássio contém Arsênico.
   3. Prepare PBS/Triton X-100: 1x PBS mais 1% ou 0,05% Triton X-100. Armazenar a 4 °C.
   4. Prepare PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) e 0,1% Tween-20. Pode ser armazenado a 4 °C por uma semana.

2. Coleção de Oócitos Drosophila em estágio tardio

1. Como oócitos de Drosophila com membranas intactas grudarão em plástico e vidro, pré-cubra o interior de um tubo de 5 ml e um pipet Pasteur por preparação de oócito com PTB.
2. Anestesia todas as moscas de ~100 a 300 leveduras com dióxido de carbono e adicione a um liquidificador contendo ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulso três vezes (~1 seg cada). Mantenha oócitos no Robb's por <20 min para evitar a ativação.
   NOTA: Alternativamente, os oócitos podem ser dissecados à mão de fêmeas. A vantagem deste método é que requer menos fêmeas. No entanto, deve-se tomar cuidado para limitar a exposição ao dióxido de carbono a apenas alguns minutos para evitar artefatos associados à hipóxia.
3. Filtre através de malha grande (~1.500 μm) em 250 ml de béquer para remover grandes partes do corpo. Se muitos abdômens intactos permanecerem na malha, ressumam o material usando o Buffer de Robb adicional e filtram novamente. Deixe resolver ~2 min, depois aspire fora da camada superior, removendo o maior número possível de grandes partes do corpo.
4. Filtre através de malha pequena (~300 μm) em um béquer de 250 ml. Enxágüe os oócitos restantes do primeiro béquer usando pipet pasteur adicional e revestido. Deixe resolver ~3 min; oócitos vão resolver. Aspirar fora todos, menos ~10 ml.
5. Despeje a maior parte dos 10 ml que caberá no tubo revestido de 5 ml. Solte, retire o líquido e repita com o restante. Enxágüe os oócitos restantes fora do béquer usando pipet pasteur adicional e revestido. Deixe se acomodar em tubo de 5 ml por ~3-5 min.

3. Tratamentos medicamentosos (opcional)

1. Cubra um segundo tubo de 5 ml com PTB para cada preparação de oócito. Adicione solvente apropriado (controle) ou droga a 1 ml Robb's cada para cada preparação de oócito(Tabela 1).
2. Divida osócitos em segundo tubo revestido de 5 ml. Solte, remova o líquido, e adicione 1 ml de Robb mais solvente em um tubo e 1 ml de Robb mais droga no segundo tubo. Nutate para o tempo adequado para tratamento medicamentoso(Tabela 1). Vamos resolver.

4. Fixação

1. Aspire todo o líquido e adicione imediatamente 1 ml de correção.
2. Opção #1: Fixação formaldeído/heptano (Buffer de fixação mais 5% de formaldeído).
   1. Conserte por 2,5 min em um nutador. Adicione 1 ml de heptano e vórtice 1 min. Deixe resolver ~1 min.
   2. Retire todo o líquido e adicione 1 ml 1x PBS. Vórtice 30 segundos. Deixe resolver ~1 min.
   3. Retire todo o líquido e encha o tubo com 1x PBS.
      NOTA: Os oócitos podem ser usados imediatamente ou mantidos no nutador por várias horas em temperatura ambiente.
3. Opção #2: Fixação formaldeído/cacodilato (Fix Mix mais 8% de formaldeído e 100 mM cacodilato).
   1. Conserte por 6 minutos em um nutador. Deixe resolver 2 min. Retire o líquido e encha o tubo com 1x PBS.
      NOTA: Os oócitos podem ser usados imediatamente ou mantidos no nutador por várias horas em temperatura ambiente.

5. Remoção de membranas ("Rolamento")

1. Usando pipet Pasteur revestido, adicione ~500 a 1.000 oócitos à parte fosco (esmaiçada) de um escorregador de vidro. Remova todas as partes do corpo e material ínteuo usando fórceps. Não deixe os oócitos secarem; adicionar 1x PBS conforme necessário.
2. Coloque uma mancha de cobertura em cima dos oócitos e suavemente "role" oócitos até que todas as membranas sejam removidas (arrastar a borda do tapa-tampa através dos oócitos funciona melhor). Verifique periodicamente o progresso sob o microscópio, adicionando mais 1x PBS conforme necessário. Tome cuidado, pois muita pressão destruirá os oócitos.

Representative Results

medicamento	solvente	Concentração de estoque	Concentração final	Tempo de tratamento	efeito
colquicina	etanol	125 mM	150 μM	10 min ou 30 min	desestabilizar não-kinetochore (10 min) ou todos (30 min) microtúbulos
paclitaxel	Dmso	10 mM	10 μM	10 min.	estabilizar microtúbulos
Binucleína 2	Dmso	25 mM	25 μM	20 min.	inibir Aurora B quinase

Tabela 1: Tratamento medicamentoso.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various