Vorbereitung von Fixed Drosophila Oocyten für die Immunostainierung: Eine High-Throughput-Methode zur Fixierung und Entfernung der äußeren Membran

Overview

Die Immunostainierung von Drosophila-Oozyten im späten Stadium kann sich aufgrund der umgebenden Membranen der Eizellen als schwierig erweisen. Dieses Video beschreibt eine Methode mit hohem Durchsatz zur Gewinnung von Eizellen, deren Fixierung und der Entfernung von Membranen zur Immunfärbung. Das vorgestellte Protokoll demonstriert diese Techniken mit späten Oozyten, die verwendet werden, um verschiedene Stadien der Meiose zu visualisieren.

Protocol

Dieses Protokoll ist aus Radford und McKim, Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).

HINWEIS: Die Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Temperaturgesteuerte Inkubatoren werden verwendet, um die Temperaturen für die Fliegenzucht und Kreuze aufrechtzuerhalten, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie Fliegen vor.
   1. Prometaphase-angereicherte Oozyten-Sammlungen.
      1. Klare erwachsene Fliegen aus gesunden, jungen Beständen oder Kreuzkulturen. Age Flaschen für zwei Tage bei 25 °C.
         HINWEIS: Im Allgemeinen werden zwei gesunde Flaschen ausreichen, obwohl für einige Kreuzkulturen mehr benötigt werden kann.
      2. Sammeln Sie nach zwei Tagen 100 bis 300 Frauen (die an dieser Stelle 0 bis 2 Tage alt sind) aus den Flaschen. Die Weibchen müssen keine Jungfrauen sein. Fügen Sie einen Tupfer Hefepaste an die Seite einer Durchstechflasche und legen Sie 30 Weibchen und 10 bis 15 Männchen jeweils in die Hefefläschchen. Alter fläschbar für zwei Tage bei 25 °C.
   2. Metaphasenangereicherte Oocyte-Sammlungen.
      1. Sammeln Sie 100 bis 300 Frauen aus Stock- oder Kreuzkulturen. Fügen Sie einen Tupfer Hefepaste an die Seite einer Durchstechflasche und legen Sie jeweils 30 Weibchen (ohne Männchen) in die Hefefläschchen. Alter fläschbar für drei bis fünf Tage bei 25 °C.
2. Bereiten Sie Lösungen vor.
   HINWEIS: Lösungen können auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.
   1. Bereiten Sie modified Robb es Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM Saccharose, 275 mM Natriumacetat, 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Glukose, 6 mM Magnesiumchlorid und 5 mM Calciumchlorid vor. Verwenden Sie 10 N 11:8 Natriumhydroxid: Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 zu bringen. Sterilisieren durch Filtration; autoklavieren. Bei -20 °C lagern. Nach Bedarf nach auftauen, um 200 ml 1x Robb es pro Oozyten-Vorbereitung vorzubereiten.
   2. Fixierungslösungen.
      1. Option #1: Bereiten Sie formaldehyd/Heptan-Fixierung vor. Fixationspuffer vorbereiten: 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) plus 150 mM Saccharose. Zur Verwendung, frisch machen mit 687,5 l Fixationspuffer und 312,5 l 16% Formaldehyd pro Oozyten-Präparat.
         ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe, während Sie Formaldehyd-Lösungen in einer Dunstabzugshaube verwenden. Abfall gemäß institutionellen Richtlinien entsorgen.
      2. Option #2: Bereiten Sie formaldehyd/Cacodylat-Fixierung vor. Fix Mix vorbereiten: 250 mM Saccharose, 100 mM Kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM Natriumacetat (pH 7,0) und 25 mM EGTA (pH 8,0). Zur Verwendung frisch machen mit 400 l Fix Mix, 100 l Kaliumkarkodylat (1 M, pH 7,2) und 500 l 16% Formaldehyd pro Oozytenpräprep.
         ACHTUNG: Kaliumcakodylat enthält Arsen.
   3. PBS/Triton X-100 vorbereiten: 1x PBS plus 1% oder 0,05% Triton X-100. Bei 4 °C lagern.
   4. PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) und 0,1% Tween-20. Kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden.

2. Sammlung von Drosophila Oocytes im späten Stadium

1. Da Drosophila-Oozyten mit intakten Membranen an Kunststoff und Glas kleben, die Innenseite eines 5 ml Tube und eine Pasteur Pipette pro Eizelle mit PTB vorlacken.
2. Anästhetisieren Sie alle 100 bis 300 Hefefliegen mit Kohlendioxid und fügen Sie zu einem Mixer mit einem 100 ml 1x Robb-Puffer hinzu. Pulsieren Sie dreimal (jeweils 1 Sek.). Bewahren Sie Oozyten in Robb es für <20 min auf, um eine Aktivierung zu vermeiden.
   HINWEIS: Alternativ können Eizellen von Weibchen von Hand seziert werden. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie weniger Weibchen benötigt. Es muss jedoch darauf geachtet werden, die Exposition gegenüber Kohlendioxid auf wenige Minuten zu begrenzen, um Artefakte im Zusammenhang mit Hypoxie zu vermeiden.
3. Filtern Sie durch großes Mesh (ca. 1.500 m) in 250 ml Becher, um große Körperteile zu entfernen. Wenn viele intakte Bauchmuskeln auf dem Netz verbleiben, schleifen Sie Material mit zusätzlichem Robb-Puffer nach und filtern Sie erneut. Lassen Sie 2 min absetzen, dann die obere Schicht absaugen und so viele der großen Körperteile wie möglich entfernen.
4. Filtern Sie durch ein kleines Mesh (ca. 300 m) in ein 250 ml Becherglas. Spülen Sie restliche Eizellen aus dem ersten Becher mit zusätzlichen Robbs und beschichteter Pasteur Pipet. Lassen Sie sich 3 min absetzen; Oozyten werden sich absetzen. Alle bis auf 10 ml absaugen.
5. Gießen Sie so viel von den 10 ml, wie in beschichtete 5 ml Tube passen. Absetzen, Flüssigkeit entfernen und mit Rest wiederholen. Spülen Sie restliche Eizellen aus becherigem Becher mit zusätzlichen Robbs und beschichteter Pasteur Pipet. Lassen Sie in 5 ml Tube für 3-5 min absetzen.

3. Arzneimittelbehandlungen (optional)

1. Beschichten Sie eine zweite 5 ml Tube mit PTB für jede Eizelle Prep. Fügen Sie für jede Eizellenvorbereitung geeignetes Lösungsmittel (Kontrolle) oder Medikament zu je 1 ml Robb es für jede Eizelle-Vorbereitung hinzu (Tabelle 1).
2. Eizellen in eine zweite beschichtete 5 ml Tube aufteilen. Absetzen, Flüssigkeit entfernen und 1 ml Robbs plus Lösungsmittel in eine Röhre und 1 ml Robbs plus Medikament in die zweite Tube geben. Nutat für angemessene Zeit für die medikamentöse Behandlung (Tabelle 1). Lassen Sie sich niederlassen.

4. Fixierung

1. Alle Flüssigkeit absaugen und sofort 1 ml Fix hinzufügen.
2. Option #1: Formaldehyd/Heptanfixierung (Fixationspuffer plus 5% Formaldehyd).
   1. Fix für 2,5 min auf einem Nutator. 1 ml Heptan und Wirbel 1 min hinzufügen. Lassen Sie die 1 min.
   2. Entfernen Sie alle Flüssigkeit, und fügen Sie dann 1 ml 1x PBS. Vortex 30 Sek. Lassen Sie die 1 min.
   3. Entfernen Sie alle Flüssigkeit, und füllen Sie dann Dasröhrchen mit 1x PBS.
      HINWEIS: Oozyten können sofort verwendet oder mehrere Stunden bei Raumtemperatur auf dem Nutator aufbewahrt werden.
3. Option #2: Formaldehyd/Cacodylat-Fixierung (Fix Mix plus 8% Formaldehyd und 100 mM Cacodylat).
   1. Fix für 6 min auf einem Nutator. Lassen Sie 2 min. Entfernen Sie Flüssigkeit, und füllen Sie dann das Rohr mit 1x PBS.
      HINWEIS: Oozyten können sofort verwendet oder mehrere Stunden bei Raumtemperatur auf dem Nutator aufbewahrt werden.

5. Entfernen von Membranen ("Rolling")

1. Mit beschichteter Pasteur-Pipette fügen Sie dem gefrosteten (sandgestrahlten) Teil einer Glasrutsche 500 bis 1.000 Eizellen hinzu. Entfernen Sie alle Körperteile und Fremdmaterial mit Zangen. Lassen Sie die Eizellen nicht austrocknen; 1x PBS bei Bedarf hinzufügen.
2. Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Eizellen und "rollen" Sie sanft Dieoozyten, bis alle Membranen entfernt sind (ziehen Sie den Rand des Coverslips über die Eizellen am besten). Überprüfen Sie den Fortschritt regelmäßig unter dem Mikroskop, und fügen Sie bei Bedarf mehr 1x PBS hinzu. Achten Sie darauf, da zu viel Druck die Eizellen zerstören wird.

Representative Results

Droge	Lösungsmittel	Lagerkonzentration	Endgültige Konzentration	Zeitpunkt der Behandlung	Wirkung
Colchicin	Ethanol	125 mM	150 m	10 min oder 30 min	Destabilisieren Nicht-Kinetochore (10 min) oder alle (30 min) Mikrotubuli
Paclitaxel	Dmso	10 mM	10 m	10 Min.	Mikrotubuli stabilisieren
Binucleine 2	Dmso	25 mM	25 m	20 Min.	Aurora B Kinase hemmen

Tabelle 1: Drogenbehandlung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various