Vorbereitung von Fixed Drosophila Oocyten für die Immunostainierung: Eine High-Throughput-Methode zur Fixierung und Entfernung der äußeren Membran
Published: April 30, 2023
Abstract
Quelle: Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J. Vis. (2016).
Die Immunostainierung von Drosophila-Oozyten im späten Stadium kann sich aufgrund der umgebenden Membranen der Eizellen als schwierig erweisen. Dieses Video beschreibt eine Methode mit hohem Durchsatz zur Gewinnung von Eizellen, deren Fixierung und der Entfernung von Membranen zur Immunfärbung. Das vorgestellte Protokoll demonstriert diese Techniken mit späten Oozyten, die verwendet werden, um verschiedene Stadien der Meiose zu visualisieren.
Protocol
Dieses Protokoll ist aus Radford und McKim, Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). HINWEIS: Die Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Temperaturgesteuerte Inkubatoren werden verwendet, um die Temperaturen für die Fliegenzucht und Kreuze aufrechtzuerhalten, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitunge…
Representative Results
Droge Lösungsmittel Lagerkonzentration Endgültige Konzentration Zeitpunkt der Behandlung Wirkung Colchicin Ethanol 125 mM 150 m 10 min oder 30 min Destabilisieren Nicht-Kinetochore (10 min)oder…
Materials
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| magnesium chloride | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
Cite This Article
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).